磷酸化蛋白鑒定實驗
實驗材料測序級膜蛋白酶試劑、試劑盒二硫蘇糖醇碘代乙酰胺乙酸溶液甲酸乙酰氯儀器、耗材螯合瓊脂糖凝膠層析介質實驗步驟這里所述的方法概括為下列幾個步驟：胰蛋白酶水解消化膜和可溶性組分中的蛋白質（見 24. 3.1 )；固相金屬螯合親和層析（IMAC) 富集磷酸肽（見 24. 3. 2 )；用串聯質譜對磷酸肽進行鑒定和測序（見 24. 3. 3 )；使用穩定同位素標記的磷酸肽的相對定量分析（見 24.3.4 )；用液相色譜-質譜（LC- MS) 確定蛋白磷酸化率（見 24.3. 5 ) 。3.1 細胞亞組分的胰蛋白酶消化酶解1. 膜組分的胰蛋白酶消化酶解膜表面結合肽的分離：( 1 ) 用含 10 mmol/L NaF ( 見注釋 2 ) 的 25 mmol/L NH4HCO3 ( 見注釋 1 ) 溶液清洗分離出來的膜制備物兩次。( 2 ) 用含 10 mmol/L NaF 的 25 mmol/L NH4HCO3 懸浮......閱讀全文
磷酸化蛋白鑒定實驗
實驗材料測序級膜蛋白酶 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?試劑、試劑盒二硫蘇糖醇 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?碘代乙酰
磷酸化蛋白鑒定實驗
實驗材料測序級膜蛋白酶試劑、試劑盒二硫蘇糖醇碘代乙酰胺乙酸溶液甲酸乙酰氯儀器、耗材螯合瓊脂糖凝膠層析介質實驗步驟這里所述的方法概括為下列幾個步驟：胰蛋白酶水解消化膜和可溶性組分中的蛋白質（見 24. 3.1 )；固相金屬螯合親和層析（IMAC) 富集磷酸肽（見 24. 3. 2 )；用串聯質譜對磷酸
磷酸化蛋白鑒定實驗
實驗材料 測序級膜蛋白酶試劑、試劑盒 二硫蘇糖醇碘代乙酰胺乙酸溶液甲酸乙酰氯儀器、耗材 螯合瓊脂糖凝膠層析介質實驗步驟 這里所述的方法概括為下列幾個步驟：胰蛋白酶水解消化膜和可溶性組分中的蛋白質（見 24. 3.1 )；固相金屬螯合親和層析（IMAC) 富集磷酸肽（見 24. 3. 2 )；用串
滲透細胞蛋白磷酸化實驗
實驗方法原理 檢測出目標蛋白是磷蛋白后，可將這個蛋白質的磷酸化過程在無細胞系統或天然細胞系統中進行研究。大多數蛋白激酶除了在細胞內還可在胞外進行許多底物的磷酸化。天然細胞的滲透化處理為得到滿意結果提供了一個有效的實驗方法，通過使用一些不同的試劑可以使細胞處于短暫的滲透狀態。這個過程使反應發生在細胞內
滲透細胞蛋白磷酸化實驗
基本方案 帶分析 備擇方案1 制備用于SDS-PAGE的天然細胞樣品 備擇方案2 制備用于等電聚焦的天然細胞樣品 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 檢測出目標
誘餌蛋白特性鑒定實驗
實驗材料 蛋白質試劑、試劑盒 CM培養基儀器、耗材 水浴鍋培養箱電轉儀實驗步驟 一、lacZ激活試驗?1. ?采用標準的亞克隆技術，將編碼目的蛋白質的DNA插入pEG202的多接頭中，構建一個符合讀框的融合蛋白。2. ?將下列組合的質粒，分別按“乙酸鋰轉化法”轉化酵母菌EGY48。（1）pBait+
誘餌蛋白特性鑒定實驗
基本方案 ? ? ? ? ? ? 實驗材料 蛋白質 試劑、試劑盒
誘餌蛋白特性鑒定實驗
實驗材料蛋白質試劑、試劑盒CM培養基儀器、耗材水浴鍋培養箱電轉儀實驗步驟一、lacZ激活試驗?1. ?采用標準的亞克隆技術，將編碼目的蛋白質的DNA插入pEG202的多接頭中，構建一個符合讀框的融合蛋白。2. ?將下列組合的質粒，分別按“乙酸鋰轉化法”轉化酵母菌EGY48。（1）pBait+pSH1
磷酸化蛋白質組鑒定技術路線及經典案例
蛋白質翻譯后修飾（PTMs）幾乎參與了細胞所有正常生命活動的過程，并發揮十分重要的調控作用。蛋白修飾已經成為國際上蛋白質研究的一個極其重要的領域，目前研究比較成熟的有磷酸化、乙酰化、糖基化、泛素化等。蛋白質磷酸化是生物體中最常見、最重要的一種蛋白質翻譯后修飾方式，它可以通過激發、調節諸多信號通路進而
蛋白質磷酸化的測定實驗
代謝標記 X射線片放射自顯影檢測32P標記的蛋白質 ? ? ? ? ? ? 實驗材料 細胞
相互作用蛋白鑒定實驗
鑒定誘餌蛋白（半乳糖苷酶） 鑒定誘餌蛋白（LacZ 的活性分析） 相互作用蛋白捕獲 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 捕捉相互作用蛋白的第一步是構建能夠表達
相互作用蛋白鑒定實驗
實驗方法原理 捕捉相互作用蛋白的第一步是構建能夠表達 LexA 與目的蛋白的融合體的質粒。這種質粒轉化到包含 LEU2 和lacZ 報道基因的報道酵母株中，并要行一系列的對照實驗來鑒定所構建的誘餌蛋白是否適用，是否需要修飾，或是否應改變酵母菌報道條件。這些對照實驗實現了誘餌蛋白在酵母菌中作為
相互作用蛋白鑒定實驗——鑒定誘餌蛋白（LacZ的活性分析）
實驗方法原理捕捉相互作用蛋白的第一步是構建能夠表達 LexA 與目的蛋白的融合體的質粒。這種質粒轉化到包含 LEU2 和lacZ 報道基因的報道酵母株中，并要行一系列的對照實驗來鑒定所構建的誘餌蛋白是否適用，是否需要修飾，或是否應改變酵母菌報道條件。這些對照實驗實現了誘餌蛋白在酵母菌中作為一種穩定蛋
磷酸化蛋白質組鑒定技術路線及經典案例介紹
今天，小編跟您聊聊磷酸化蛋白質組鑒定！ 蛋白質翻譯后修飾（PTMs）幾乎參與了細胞所有正常生命活動的過程，并發揮十分重要的調控作用。蛋白修飾已經成為國際上蛋白質研究的一個極其重要的領域，目前研究比較成熟的有磷酸化、乙酰化、糖基化、泛素化等。 蛋白質磷酸化是生物體中最常見、最重要的
滲透細胞蛋白磷酸化實驗——帶分析
本實驗討論用三磷酸核苷在可滲透細胞和分離的細胞組分體外標記蛋白的策略。這類實驗在大多數情況下還是以 [γ-32P] ATP 作為外源性磷酸供體。盡管在特殊情況下[γ-32P] GTP 也能被用于蛋白質標記。實驗方法原理檢測出目標蛋白是磷蛋白后，可將這個蛋白質的磷酸化過程在無細胞系統或天然細胞系統中進
相互作用蛋白鑒定實驗——鑒定誘餌蛋白（半乳糖苷酶）
通過確定與之結合的其他蛋白質來理解某種特定蛋白質的功能，常常是十分有用的方法。這可以通過從文庫中選擇或篩選與靶蛋白相互作用的新蛋白來實現。現有一種特別有用的方法即雙雜交系統或相互作用阱， 用來測定新的相互作用蛋白，這種方法采用充當「試管」的酵母菌和一種報道系統的轉錄激活作用來識別結合蛋白。本方法也可
磷酸化絲裂原活化蛋白激酶激酶1抗體的鑒定步驟
磷酸化絲裂原活化蛋白激酶激酶1抗體的鑒定：1）抗體的效價鑒定：不管是用于診斷還是用于治療,制備抗體的目的都是要求較高效價。不同的抗原制備的抗體,要求的效價不一。鑒定效價的方法很多,包括有試管凝集反應,瓊脂擴散試驗,酶聯免疫吸附試驗等。常用的抗原所制備的抗體一般都有約成的鑒定效價的方法,以資比較。如制
胰蛋白酶切磷酸化多肽作圖實驗
胰蛋白酶切蛋白質樣品的制備雙向薄層電泳與層析分離多肽片段反向高效液相層析繪制多肽圖譜實驗材料蛋白質 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?試劑、試劑盒甲醇 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?
胰蛋白酶切磷酸化多肽作圖實驗
實驗材料 蛋白質試劑、試劑盒 甲醇電泳緩沖液儀器、耗材 凝膠電泳實驗步驟 1. 用單向或者雙向凝膠電泳將 32P 標記的目的蛋白質與其他不需要的成分分開。2. 電泳結束后，用 50% 甲醇清洗三次，時間控制在 6 小時，去處 SDS 和電泳緩沖液將凝膠放在兩張塞熱玢膜（Bio-Rad) 之間吸干。用
胰蛋白酶切磷酸化多肽作圖實驗
胰蛋白酶切蛋白質樣品的制備 雙向薄層電泳與層析分離多肽片段 反向高效液相層析繪制多肽圖譜 ? ? ? ? ? ? 實驗材料 蛋白質
蛋白質磷酸化的測定實驗—代謝標記
實驗材料細胞儀器、耗材培養瓶實驗步驟1. 用 60 mm 或 100 mm 培養瓶，在完全培養基中培養細胞至所希望的密度。2. 用預熱的低磷酸培養基（無放射性磷酸鹽）沖洗兩次，然后加入含 0.5~1 mCi32P/ml 的低磷酸培養基（50~100 μmol/L 無機磷酸）。3. 培養結束后，回收?
利用植物蛋白質芯片研究蛋白磷酸化實驗
實驗材料異丙基 β-D-硫代半乳糖苷試劑、試劑盒非變性裂解液非變性洗滌液非變性洗脫液苯甲基磺酰氟儀器、耗材超聲勻漿器聚丙烯柱實驗步驟3.1 非變性條件下重組激酶的純化用于磷酸化篩選的激酶必須是可溶和有活性的，且無其他激酶參雜的純化激酶。因此，我們可以從 cDNA 表達文庫中，大量生產和純化組氨酸標記
利用植物蛋白質芯片研究蛋白磷酸化實驗
實驗材料?異丙基 β-D-硫代半乳糖苷試劑、試劑盒?非變性裂解液非變性洗滌液非變性洗脫液苯甲基磺酰氟儀器、耗材?超聲勻漿器聚丙烯柱實驗步驟 3.1 非變性條件下重組激酶的純化用于磷酸化篩選的激酶必須是可溶和有活性的，且無其他激酶參雜的純化激酶。因此，我們可以從 cDNA 表達文庫中，大量生產和純
利用植物蛋白質芯片研究蛋白磷酸化實驗
實驗材料：異丙基 β-D-硫代半乳糖苷 ? ? ?? 試劑、試劑盒：非變性裂解液 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?非變性洗滌液 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?
相互作用蛋白鑒定實驗——相互作用蛋白捕獲
實驗方法原理實驗要經過兩次連續大量的酵母菌平板篩選過程。酵母菌含有 LexA 融合探針、報道基因和插入PJG4-5（見圖19.1.6）的 GAL 啟動子控制下的 cDNA 表達文庫。最近，已有可供用于這個系統的文庫。實驗材料攜帶適當質粒組合的酵母菌試劑、試劑盒完全（CM）缺失成分液體培養基含有如下指
方案4－離線－microIMAC－富集磷酸化蛋白實驗
實驗材料來自目標磷酸化蛋白的多肽試劑、試劑盒乙酸銨EDTA氯化鐵儀器、耗材接口和組合件氮壓縮氣體IMAC樹脂聚酷亞胺涂層熔融石英毛細管壓力管聚四氟乙烯管實驗步驟一、IMAC 微柱的構建制備二、磷酸化多肽的富集展開
蛋白質磷酸化
Tyrosine Kinase Assay Using Synthetic Peptides?(T. Miller)Small synthetic peptide substrates are especially well suited for applications such as assay
張麗華發文：N磷酸化修飾蛋白質的富集和鑒定方法
摘要 蛋白質磷酸化修飾在細胞的信號轉導、代謝、發育等生命過程中發揮著重要作用。除了研究較為透徹的發生在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸側鏈羥基的O-磷酸化修飾之外，近年來，發生在組氨酸、精氨酸和賴氨酸側鏈氨基的N-磷酸化修飾受到了越來越廣泛的關注。然而，由于N-磷酸化修飾具有獨特的P-N鍵結構，導致其化
胰蛋白酶切磷酸化多肽作圖實驗—樣品制備
實驗材料蛋白質試劑、試劑盒甲醇電泳緩沖液儀器、耗材凝膠電泳實驗步驟1. 用單向或者雙向凝膠電泳將?32P 標記的目的蛋白質與其他不需要的成分分開。2. 電泳結束后，用 50% 甲醇清洗三次，時間控制在 6 小時，去處 SDS 和電泳緩沖液將凝膠放在兩張塞熱玢膜（Bio-Rad) 之間吸干。用放射性墨
非標記蛋白質的磷酸化作用分析實驗
免疫印跡分析 化學發光法 ? ? ? ? ? ? 實驗材料 蛋白質樣品 試劑、試劑盒