DNA重組（DNArecombination）技術：DNA序列測定1
㈣ DNA聚合酶 如前所述，選用合適的DNA聚合酶進行測序反應也是保證測序質量的重要因素之一。常用于雙脫氧末端終止法測序的有幾種不同的酶： 1．大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段） 此酶是最早用于建立Sanger測序的酶。但通常會有兩個問題：①Klenow片段的持續合成能力較低，通常只能得到約250~350個核苷酸的序列，而且由于聚合酶隨機從模板上解離而終止鏈延伸，通常會產生較高的本底和假帶；②對同聚核苷酸段或其他含牢固二級結構的區域復制效能低下。但此酶價格便宜，對已知序列的亞克隆進行鑒定仍有應用價值。2．測序酶（sequenase） 該酶是一種經過化學修飾的T7噬菌體DNA聚合酶，其原來很強的3′→5′外切酶活性，經化學修飾后大部分被消除。目前常用的測序酶大都是基因工程產品，完全缺失3′→5′外切酶活性，具有活性非常穩定可靠、持續合成能力強和聚合速度高等優點，是測定較長DNA的首選酶。市售的各種以該......閱讀全文
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA序列測定1
㈣ DNA聚合酶 如前所述，選用合適的DNA聚合酶進行測序反應也是保證測序質量的重要因素之一。常用于雙脫氧末端終止法測序的有幾種不同的酶： 1．大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段） 此酶是最早用于建立Sanger測序的酶。但通常會有兩個問題：①Klenow片段的持續合成能力較
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA序列測定2
目前應用的兩種快速序列測定技術是Sanger等（1977）提出的酶法（雙脫氧鏈終止法）和Maxam（1977）提出的化學降解法。雖然其原理大相徑庭，但這兩種方法都同樣生成相互獨立的若干組帶放射性標記的寡核苷酸，每組核苷酸都有共同的起點，卻隨機終止于一種（或多種）特定的殘基，形成一系列以某一特定核苷酸
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA序列測定3
2．利用末端轉移酶和α-32P-ddNTP標記DNA的3ˊ-末端 在二價陽離子存在下，末端轉移酶催化dNTP加入DNA分子的3ˊ-羥基末端，如果作為底物的核苷酸經過修飾（如ddNTP），則可以在DNA的3ˊ-OH上僅加入一個核苷酸。對于雙鏈DNA片段，亦存在DNA的兩側均被標記問題，可通過上述同
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA重組與鑒定1
重組DNA是在體外用限制性內切酶，將不同來源的DNA分子進行特異地切割，獲得的目的基因或DNA片段與載體重新連接，從而組成一個新的DNA雜合分子。重組的DNA分子能夠通過一定的方式進入相應的宿主細胞，在宿主細胞中進行無性增殖，獲得大量的目的基因或DNA片段，此過程稱基因克隆。重組的DNA分子也能夠在
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA重組的載體1
載體（vector）是攜帶靶DNA（目的DNA）片段進入宿主細胞進行擴增和表達的運載工具。常用的載體是通過改造天然的細菌質粒、噬菌體和病毒等構建而成。目前已構建成的載體主要有質粒載體、噬菌體載體、病毒載體和人工染色體等多種類型，亦可根據其用途不同分為克隆載體和表達載體二類。載體的構建和選擇應考慮以下
DNA重組技術(DNA－Recombination)
一、DNA 的酶切與連接（1）酶切反應：同質粒DNA 的鑒定，只不過是質粒DNA 換為載體DNA 。若大量酶切，則成比例增加。（2）加2倍體積的預冷無水乙醇和1/10體積的3mol/l NaAc混勻，-20℃2h以上。（3）15000rpm離心15min，棄上清。（4）加入75%乙醇洗滌2次，離心棄
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA重組與鑒定3
當多克隆位點有外源DNA片段插入時，破壞此酶的N端閱讀框架，產生無α互補功能的N端片段，因此在帶有外源DNA片段的細菌在含有IPTG/X-gal的培養基上呈白色，見圖7-11 。如果外源DNA插入片段相當短，不破壞β-半乳糖苷酶的氨基端氨基酸序列的閱讀框，有時產生的重組體菌落不呈白色而是呈淺藍色。4
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA重組的載體3
在作為載體時，這些噬菌體有一個很大的優點，即克隆到M13mp載體的外源DNA片段（雙鏈），在子代噬菌體便成為了單鏈形式。故應用M13mp進行克隆，可方便地分離到大量含有外源DNA某一單鏈的DNA分子。這種單鏈DNA可在下列工作中作模板：①主要用作雙脫氧鏈終止法進行DNA序列測定的模板；②制備僅有一條
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA重組與鑒定2
（1）CaCl2處理以后的轉化: 當細菌處于0℃、二價陽離子（如Ca2+、Mg2+等）低滲溶液中時，細菌細胞膨脹成球形，處于感受態；此時轉化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復合物粘附于細胞表面，重組DNA在42℃短時間熱沖擊后吸附在細胞表面，在豐富培養基中生長數小時后，球狀細胞恢復原
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA重組的載體2
二、噬菌體載體作為細菌寄生物的噬菌體，大多數具有編碼多種蛋白質的基因，能利用宿主細胞的蛋白質合成體系，進行生長和增殖。構建的噬菌體載體，以λ噬菌體、M13和粘粒最為常用。㈠ λ噬菌體載體野生型λDNA是一種基因組為4.8 kb的線性雙鏈DNA，全部序列已知，共編碼50多個基因。其中約一半基因參與
DNA重組（DNA－recombination）技術：工具酶
一、限制性內切酶限制性內切酶（restriction endonucleases，RE）是其中最重要的工具酶之一。它是一類核酸水解酶，能識別和切割雙鏈DNA分子中的特定核苷酸序列。（一）命名原則限制性內切酶大多從細菌中發現，根據來源進行命名，限制酶的第一個字母（大寫，斜體）為宿主菌的屬名，第二、第三
DNA重組（DNA－recombination）技術：外源基因的蛋白表達1
通過外源DNA的重組、克隆、以及鑒定，可以獲得所需的特異DNA克隆。外源克隆基因在某種表達載體及適宜的宿主細胞中可表達為相應的蛋白質，這就組成了外源基因的蛋白表達系統。表達后的蛋白質必須具有原來的生物學活性，這是基于正確的基因轉錄、轉錄后加工、mRNA翻譯及翻譯后修飾，同時與表達載體的結構和表達體系
DNA重組（DNA－recombination）技術：外源基因的蛋白表達4
（3）CHO細胞穩定表達系統：動物細胞瞬時表達系統中外源基因沒有穩定地整合到宿主細胞染色體中，一染色體外DNA的形式存在。因而只能瞬時表達。要使外源基因在宿主細胞中高效、穩定地表達，必須建立一個穩定表達系統，包括適宜的表達載體、有效的基因轉染、標記基因和目標基因的選擇與共擴增、受體適當的受體細胞和培
DNA重組（DNA－recombination）技術：外源基因的蛋白表達2
2.包涵體的分離與純化細胞破碎時提取細胞內產物的關鍵。對于細菌的裂解常用的有酶溶法、超聲破碎法、化學滲透法、玻璃珠研磨等。包涵體可通過超聲波、勻漿等常規的方法是菌體破碎后，離心就可得到。密度梯度離心后可得到高純度的包涵體。包涵體一般不溶于水，為了獲得可溶性的蛋白質可加入強蛋白質變性劑后使其溶解。一般
DNA重組（DNA－recombination）技術：外源基因的蛋白表達3
（6）遺傳標記： 從成千上萬個哺乳細胞中，檢測出極少數的含DNA重組體的轉染細胞，并鑒定已導入外源DNA是哺乳動物細胞基因表達系統的一個關鍵內容。因此，在真核生物表達載體上必須附有標記基因，才能進行篩選。常用的標記基因有：胸苷激酶基因（thymidine kinase，TK）、二氫葉酸還原酶
DNA序列測定技術
DNA序列測定技術序列測定的技術和策略Sanger雙脫氧鏈終止法Maxam－Gilbert DNA化學降解法測序策略 目前應用的兩種快速序列測定技術是Sanger等（1977）提出的酶法及Maxam和Gilbert(1977)提出的化學降解法。雖然其原理大相徑庭，但這兩種方法都是同樣生成互相獨立的
DNA序列測定技術
DNA序列測定技術序列測定的技術和策略Sanger雙脫氧鏈終止法Maxam－Gilbert DNA化學降解法測序策略目前應用的兩種快速序列測定技術是Sanger等（1977）提出的酶法及Maxam和Gilbert(1977)提出的化學降解法。雖然其原理大相徑庭，但這兩種方法都是同樣生成互相獨立的若干
DNA序列分析技術1
物種的遺傳多樣性在本質上是DNA 一級序列的多樣性。近年來，隨著DNA 測序技術的迅速發展和日益普及，DNA 測序在遺傳多樣性的研究中正在起著越來越大的作用。本章將介紹目前在遺傳多樣性研究中常用的一種手動和一種全自動雙鏈DNA 測序方法。1.DNA 模板的制備在遺傳多樣性的研究中，由于樣本量一般都較
體外DNA重組技術1
在體外將兩個或多個來源相同或不相同的DNA片段連接成新的重組DNA分子，再轉到特定宿主細胞中進行自主復制并表達。這是分子生物學中的基本技術。DNA重組技術的基本程序包括：（1）獲得外源DNA：外源DNA是進行DNA重組的目的DNA片段，一般采用 DNA聚合酶鏈式反應(PCR)或逆轉錄-DNA聚合酶鏈
DNA重組技術
連接反應的策略?? 可以采用幾種策略來進行外源ＤＮＡ片段和質粒載體的連接。對此，可依據外源ＤＮＡ片段未的性質，以及質粒載體與外源ＤＮＡ上限制酸切位點的性質來作出選擇。（一）外源ＤＮＡ片段未的性質帶有各種未的外源ＤＮＡ的克隆方法見下表：────────────────────────────────
DNA微序列技術
·?????????Protocols for Making Drosophila Arrays?(Stanford U.)Detailed protocol for making arrays including PCR Amplification of cDNAs for Printing,?
DNA－序列分析技術
試劑、試劑盒 瓊脂糖TE 水飽和酚無水乙醇70％乙醇TEMED測序酶溴化乙錠儀器、耗材 電泳儀離心管離心機冰浴箱恒溫板DNA 測序儀
DNA－序列分析技術
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 本節描述運用Perkin-Elmer 公司的373 和377 型全自動DNA 測序儀進行雙鏈DNA 測序的方法。熱循環測序反應使用 Applied Biosystems Inc.的DyeDeoy TM Terminator
DNA－序列分析技術
DNA序列分析技術可用于：（1）分析物種的遺傳多樣性；（2）鑒定新的物種；（3）用于比較基因組學。實驗方法原理本節描述運用Perkin-Elmer 公司的373 和377 型全自動DNA 測序儀進行雙鏈DNA 測序的方法。熱循環測序反應使用 Applied Biosystems Inc.的DyeDe
DNA重組技術2
?感受態細胞的制備(一)制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態細胞 下述操作方案是由Hanahan(1983)提供的，所制備的大腸桿菌DHl、DH5和ＭＭ249感受態細胞培養物能使每微克超螺旋ＤＮＡ以≥5x108轉化菌落的頻率進行轉化，其他大多數大腸桿菌菌株的最高轉化率大約只有前述菌株的1/10-1/5。
重組－DNA－技術介紹
中文名稱重組 DNA 技術英文名稱recombinant DNA technique定 義在體外將兩個或多個不同的DNA片段全部或部分構建成一個DNA分子的方法。應用學科細胞生物學（一級學科），細胞生物學技術（二級學科）
DNA重組技術－連接
實驗概要? ? ? ? 體外連接獲得重組分子，用于轉化受體細胞。實驗原理? ? 質粒具有穩定可靠和操作簡便的優點。如果要克隆較小的DNA片段(＜10kb)且結構簡單，質粒要比其它任何載體都要好。在質粒載體上進行克隆，從原理上說是很簡單的，先用限制性內切酶切割質粒DNA和目的DNA片段， ?然后體外使
重組－DNA－技術簡介
中文名稱重組 DNA 技術英文名稱recombinant DNA technique定 義在體外將兩個或多個不同的DNA片段全部或部分構建成一個DNA分子的方法。應用學科細胞生物學（一級學科），細胞生物學技術（二級學科）
DNA序列測定的技術和策略
目前應用的兩種快速序列測定技術是Sanger等（1977）提出的酶法及Maxam和Gilbert(1977)提出的化學降解法。雖然其原理大相徑庭，但這兩種方法都是同樣生成互相獨立的若干組帶放射性標記的寡核苷酸，每組寡核苷酸都有固定的起點，但卻隨機終止于特定的一種或者多種殘基上。由于DNA上的每一個堿
DNA自動序列測定試驗
[實驗原理]DNA 測序（DNA sequencing）是對DNA 分子的一級結構的分析。其基本原理是DNA 的復制反應體系中需要存在DNA 聚合酶、DNA 模板、寡核苷酸引物和dNTP，引物和模板退火形成雙鏈后，DNA 聚合酶在引物的引導下在模板鏈上沿3’→5’的方向移動，dNTP 按照堿