酵母三雜交系統檢測和分析RNA蛋白相互作用實驗
酵母三雜交系統（yeast three-hybrid system）可用于分析蛋白質與 RNA 間的相互作用。在酵母三雜交系統中，RNA 蛋白質相互作用導致報道基因的轉錄，可以通過細胞生長、克隆顏色或特異的酶活性檢測蛋白質與 RNA 的相互作用。本實驗來源「RNA 實驗指導手冊」主編：鄭曉飛。實驗方法原理酵母三雜交系統（yeast three-hybrid system）可用于分析蛋白質與 RNA 間的相互作用。在酵母三雜交系統中，RNA 蛋白質相互作用導致報道基因的轉錄，可以通過細胞生長、克隆顏色或特異的酶活性檢測蛋白質與 RNA 的相互作用。試劑、試劑盒YPD 和 SD 培養基鮭精 DNAPEG 3350TE 緩沖液LiAcDMSOZ 緩沖液實驗步驟一、引入 RNA 質粒和 cDNA 文庫通常首先將 RNA 質粒轉化到宿主菌株-L40coat 內，得到包含 RNA 質粒的細胞，再轉化一個融合了轉錄激活區的 cDNA 文庫（雜......閱讀全文
酵母三雜交系統檢測和分析RNA蛋白相互作用實驗
酵母三雜交系統（yeast three-hybrid system）可用于分析蛋白質與 RNA 間的相互作用。在酵母三雜交系統中，RNA 蛋白質相互作用導致報道基因的轉錄，可以通過細胞生長、克隆顏色或特異的酶活性檢測蛋白質與 RNA 的相互作用。本實驗來源「RNA 實驗指導手冊」主編：鄭曉飛。實驗方
酵母三雜交系統檢測和分析RNA蛋白相互作用實驗
實驗方法原理 酵母三雜交系統（yeast three-hybrid system）可用于分析蛋白質與 RNA 間的相互作用。在酵母三雜交系統中，RNA 蛋白質相互作用導致報道基因的轉錄，可以通過細胞生長、克隆顏色或特異的酶活性檢測蛋白質與 RNA 的相互作用。試劑、試劑盒 YPD 和 SD 培養基鮭
酵母三雜交系統檢測和分析RNA蛋白相互作用
一、引入 RNA 質粒和 cDNA 文庫通常首先將 RNA 質粒轉化到宿主菌株-L40coat 內，得到包含 RNA 質粒的細胞，再轉化一個融合了轉錄激活區的 cDNA 文庫（雜交 RNA 對宿主細胞幾乎沒有毒性，與用于雙雜交篩選的一些雜交蛋白
酵母雙雜交原理（蛋白相互作用）
?概述酵母雙雜交系統由Fields和Song等首先在研究真核基因轉錄調控中建立。典型的真核生長轉錄因子， 如GAL4、GCN4、等都含有二個不同的結構域: DNA結合結構域（DNA-binding domain）和轉錄激活結構域（transcription-activating domain）。前者
酵母雙雜交系統的實驗步驟
酵母雙雜交系統的實驗步驟?1.?將報告基因p8op-LacZ轉化酵母EGY48菌株，用培養基SD/-Ura篩選。2.?同時構建DNA文庫，并純化足夠的質粒以轉化酵母細胞。3.?構建DNA-BD/靶蛋白質粒pLexA-X，作為釣餌（bait）。4.?將上述釣餌質粒pLexA-X轉化EGY48（p8op
酵母雙雜交系統
·?????????Yeast Two-Hybrid System?(Finley Lab)This is one of the most comprehensive and detailed guide to yeast two-hybrid system technique with intro
采用PACE分析RNA肽相互作用實驗
實驗方法原理 聚丙烯酰胺共電泳（poiyacrylamide coelectrophuresis，PACE ) 檢測是相對較晚發展起來的定量分析蛋白質、肽與 DNA 或 RNA 相互作用的方法。實驗材料 低放射性標記物RNA 底物試劑、試劑盒 TBE 凝膠儲存緩沖液電泳緩沖液丙烯酰胺儲存液過硫酸銨考
采用PACE分析RNA肽相互作用實驗
聚丙烯酰胺共電泳（poiyacrylamide coelectrophuresis，PACE ) 檢測是相對較晚發展起來的定量分析蛋白質、肽與 DNA 或 RNA 相互作用的方法。本實驗來源「RNA 實驗指導手冊」主編：鄭曉飛。實驗方法原理聚丙烯酰胺共電泳（poiyacrylamide coelec
采用PACE分析RNA肽相互作用實驗
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 聚丙烯酰胺共電泳（poiyacrylamide coelectrophuresis，PACE ) 檢測是相對較晚發展起來的定量分析蛋白質、肽與 DNA 或 RNA 相互作用的方法。
酵母雙雜交系統的發展和應用
隨著對多種重要生物的大規模基因組測序工作的完成，基因工程領域又迎來了一個新的時代---功能基因組時代。它的任務就是對基因組中包含的全部基因的功能加以認識。生物體系的運作與蛋白質之間的互相作用密不可分，例如：DNA合成、基因轉錄激活、蛋白質翻譯、修飾和定位以及信息傳導等重要的生物過程均涉及到蛋白質復合
酵母雙雜交系統簡介
酵母雙雜交系統酵母雙雜交系統是在真核模式生物酵母中進行的，研究活細胞內蛋白質相互作用，對蛋白質之間微弱的、瞬間的作用也能夠通過報告基因的表達產物敏感地檢測得到，它是一種具有很高靈敏度的研究蛋白質之間關系的技術。大量的研究文獻表明，酵母雙雜交技術既可以用來研究哺乳動物基因組編碼的蛋白質之間的互作，也可
酵母雙雜交實驗
實驗概要本實驗構建了Bait載體和prey載體，酵母雙雜交后，應用CPRG法定量測試了蛋白質相互作用。實驗步驟1. Bait載體的構建將高保真PCR擴增的OsCCTlb(引物為OsCCT1bEcoRI5'和OsCCTlbXhoI3')和OsCNTlb(引物為OsCNTlb ? Eco
酵母雙雜交系統逆雙雜交系統的介紹
在研究蛋白質的結構功能特點、作用方式過程中，有時還要通過突變、加抑制劑等手段破壞蛋白質間的相互作用。針對實際工作中的這種需要，Vidal等人發展了所謂的逆雙雜交系統（reverse two-hybrid system）。這項技術的關鍵是報道基因URA3的引入。URA3基因在這里起到了反選擇的作用
酵母雙雜交系統的功能特點和應用
酵母雙雜交系統是將待研究的兩種蛋白質分別克隆（融合）到酵母表達質粒的轉錄激活因子（如GAL4等）的DNA結合結構域（DNA-BD）和轉錄激活域（AD）上，構建成融合表達載體，從表達產物分析兩種蛋白質相互作用的系統。
雙雜交和其他雙成分系統實驗(三)
第三階段? 陽性相互作用的再次確定材料緩沖液和溶液乙酸銨（7.5 ml/L)氯仿乙醇異丙醇裂解液酶解酶 100T 以 2~5 mg/ml 溶解于拯救緩沖液中或β-葡糖醛酸酶 100000 單位/ml(Sigma）按 1:50 稀釋于拯救緩沖液中每次使用均需配置新鮮的溶液。酚（早衡至 pH8.0)拯救
雙雜交和其他雙成分系統實驗（三）
方法轉化文庫1. 挑選一個在第一階段的原始對照試驗中狀態最好的表達誘餌蛋白和 lexAop-lacZ 報道子的酵母菌落，接種于 20 ml CM(Glu)-Ura-His 液體培養基中，30°C 搖動過夜培養。重要：應該在用文庫重新轉化之前 7~10d 內，將誘餌蛋白和 lexAop-lacZ 報道
酵母雙雜交系統的應用
酵母雙雜交系統能在體內測定蛋白質的結合作用，具有高度敏感性。主要是由于：①采用高拷貝和強啟動子的表達載體使雜合蛋白過量表達。②信號測定是在自然平衡濃度條件下進行， 而如免疫共沉淀等物理方法為達到此條件需進行多次洗滌，降低了信號強度。③雜交蛋白間穩定度可被激活結構域和結合結構域結合形成轉錄起始復合物而
凝膠阻滯實驗分析RNA蛋白質作用常數實驗
實驗方法原理 凝膠阻滯實驗（gel reiardadon assay，又稱為 mobthty shift assay）方法簡單、靈敏，可以定量的特性使它在研究轉錄和基因調控中廣泛的應用。目前通常用于 RNA ( 或 DNA ) 結合蛋白的純化，確定一種已知或可能的 RNA 結合蛋白所識別
凝膠阻滯實驗分析RNA蛋白質作用常數實驗
凝膠阻滯實驗（gel reiardadon assay，又稱為 mobthty shift assay）方法簡單、靈敏，可以定量的特性使它在研究轉錄和基因調控中廣泛的應用。目前通常用于 RNA ( 或 DNA ) 結合蛋白的純化，確定一種已知或可能的 RNA 結合蛋白所識別的序列，建立反應常數（如親
凝膠阻滯實驗分析RNA蛋白質作用常數實驗
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 凝膠阻滯實驗（gel reiardadon assay，又稱為 mobthty shift assay）方法簡單、靈敏，可以定量的特性使它在研究轉錄和基因調控中廣泛的應用。目前通常用于 RNA ( 或 DNA ) 結合蛋
RNA－蛋白質的相互作用2
葉綠體mRNA3’末端的體外加工l??????RNA加工反應1．在1.5ml微量離心管中加入下列反應液：緩沖液IVT（20×）????????????????????????????0.5μl葉綠體蛋白提取物（20μg）??????????????????????Lμl緩沖液E???????????
RNA－蛋白質的相互作用1
葉綠體RNA的體外加工與紫外交聯分析RNARNA的合成l??????DNA模板的線性化1．根據供應商的指導用合適的限制酶酶解含有DNA模板（如亞克隆在轉錄載體如pBluescript?（Stratagene）上的菠菜葉綠體psbA基因）的質粒（Schuster and Gruissem1991）。2
酵母雙雜交系統的研究過程
Fields等人的工作標志雙雜交系統的正式建立。他們以與調控SUC2基因有關的兩個蛋白質Snf1和Snf2為模型，將前者與Gal4的BD結構域融合，另外一個與Gal4的AD結構域的酸性區域融合，由BD和AD形成的融合蛋白一般分別稱之為“誘餌”（bait）和“獵物”或靶蛋白（prey or targe
酵母雙雜交系統的研究過程
Fields等人的工作標志雙雜交系統的正式建立。他們以與調控SUC2基因有關的兩個蛋白質Snf1和Snf2為模型，將前者與Gal4的BD結構域融合，另外一個與Gal4的AD結構域的酸性區域融合，由BD和AD形成的融合蛋白一般分別稱之為“誘餌”（bait）和“獵物”或靶蛋白（prey or tar
關于酵母雙雜交系統的簡介
酵母雙雜交系統是將待研究的兩種蛋白質分別克隆（融合）到酵母表達質粒的轉錄激活因子（如GAL4等）的DNA結合結構域（DNA-BD）和轉錄激活域（AD）上，構建成融合表達載體，從表達產物分析兩種蛋白質相互作用的系統。
簡述酵母雙雜交系統的應用
酵母雙雜交系統能在體內測定蛋白質的結合作用，具有高度敏感性。 主要是由于： ①采用高拷貝和強啟動子的表達載體使雜合蛋白過量表達。 ②信號測定是在自然平衡濃度條件下進行， 而如免疫共沉淀等物理方法為達到此條件需進行多次洗滌，降低了信號強度。 ③雜交蛋白間穩定度可被激活結構域和結合結構域結合
酵母雙雜交系統的技術步驟
1.將待測基因與Gal4或LexA或其他合適蛋白的DNA結合域融合構建誘餌質粒；2.將誘餌質粒轉化缺乏報告基因啟動子的酵母細胞株中，選擇被轉化的酵母；3.再將文庫質粒轉化到酵母中；4.通過報告基因的功能篩選相互作用的蛋白。
利用雙雜交系統相互作用阱／篩選特定蛋白肽適配體實驗
實驗材料DNA酵母株試劑、試劑盒PCR 引物聚乙二醇甘油存儲液Tris·ClX-gal 平板完全極限（CM） 缺失成分培養基和平板儀器、耗材30℃ 和 42℃ 培養箱或水浴實驗步驟實驗所需「材料」、「試劑」、「耗材」具體見「其他」1. 使用標準的亞克隆技術，將編碼誘餌蛋白的 DNA 插入 PEG20
關于酵母雙雜交系統的發展介紹
發展起來的各種雙雜交系統大多是以Fields等人建立的系統為基礎的。這些新系統主要對報道基因、“誘餌”表達載體以及“獵物”表達載體等做了一些改進。其中一個重要改進是引入額外的報道基因，如廣泛采用的HIS3基因。經過改造帶有HIS3報道基因的酵母細胞，只有當HIS3被啟動表達才能在缺乏組氨酸的選擇
簡述酵母雙雜交系統的技術步驟
1.將待測基因與Gal4或LexA或其他合適蛋白的DNA結合域融合構建誘餌質粒； 2.將誘餌質粒轉化缺乏報告基因啟動子的酵母細胞株中，選擇被轉化的酵母； 3.再將文庫質粒轉化到酵母中； 4.通過報告基因的功能篩選相互作用的蛋白。