目的基因的亞克隆
目的基因的亞克隆所謂亞克隆就是對已經獲得的目的DNA片段進行重新克隆，其目的在于對目的DNA進行進一步分析，或者進行重組改造等。 亞克隆的基本過程包括：(1)目的DNA片段和載體的制備；(2)目的DNA片段和載體的連接；(3)連接產物的轉化；(4)重組子篩選。 一、試劑準備1．LB液體培養基：胰化蛋白胨（細菌培養用）10g，酵母提取物（細菌培養用） 5g，NaCl 10g，加ddH2O 至1000ml，完全溶解，分裝小瓶，15lbf/in2高壓滅菌20min。2．1.5%瓊脂LB固體培養基: 稱取1.5g瓊脂粉放入300ml錐形瓶,加100ml LB，15 lbf/in2 高壓滅菌20min，稍冷卻，制備平皿。3．IPTG、X-Gal4．0.1M MgCl2 ：15 lbf/in2高壓滅菌20min，0℃冰浴備用。5．0.1M CaCl2（以20%甘油水溶液配制）：15 lbf/in......閱讀全文
目的基因的亞克隆
實驗材料?E.coli JM109試劑、試劑盒?牛肉膏胰蛋白胨NaCl微量細菌基因組抽提試劑盒BamH IXho1 核酸內切酶凝膠電泳回收試劑盒儀器、耗材?高速臺式冷凍離心機水平電泳儀漩渦混合儀紫外檢測儀凝膠成像分析系統微量移液器及吸頭
目的基因的亞克隆
實驗題目 ：目的基因的亞克隆一、實驗目的1、掌握細菌基因組提取的方法和原理。2、掌握限制性核酸內切酶處理基因組及其結果分析。3、掌握基因片段回收的方法。二、實驗原理細菌基因組的提取：通過堿法或者酶法裂解細菌之后，可以將胞內的核酸和蛋白質全釋放出來。DNA溶于1mol/L的NaCl中，不溶于 0.
目的基因的亞克隆
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 亞克隆的基本過程包括：(1)目的DNA片段和載體的制備；(2)目的DNA片段和載體的連接；(3)連接產物的轉化；(4)重組子篩選。 實驗材料
目的基因的亞克隆
目的基因的亞克隆可應用于：（1）進一步分析目的基因；（2）基因重組。實驗方法原理亞克隆的基本過程包括：(1)目的DNA片段和載體的制備；(2)目的DNA片段和載體的連接；(3)連接產物的轉化；(4)重組子篩選。實驗材料E.coli JM109試劑、試劑盒牛肉膏胰蛋白胨NaCl微量細菌基因組抽提試劑盒
目的基因的亞克隆
目的基因的亞克隆所謂亞克隆就是對已經獲得的目的DNA片段進行重新克隆，其目的在于對目的DNA進行進一步分析，或者進行重組改造等。??? 亞克隆的基本過程包括：(1)目的DNA片段和載體的制備；(2)目的DNA片段和載體的連接；(3)連接產物的轉化；(4)重組子篩選。?一、試劑準備1．LB液體培養基：
目的基因的亞克隆1
所謂亞克隆就是對已經獲得的目的DNA片段進行重新克隆，其目的在于對目的DNA進行進一步分析，或者進行重組改造等。亞克隆的基本過程包括：(1)目的DNA片段和載體的制備；(2)目的DNA片段和載體的連接；(3)連接產物的轉化；(4)重組子篩選。 一、試劑準備 1．LB液體培養基：胰化蛋白胨（細
目的基因的亞克隆2
2. 連接產物的轉化⑴ 取100μl貯存于-70℃鈣化菌，冰浴化開；⑵ 加入適量連接產物（一般不超過10μl，輕輕混勻，冰浴20min；⑶ 于42℃熱休克90s，迅速轉移至冰浴中，繼續冰浴2-3min；⑷ 加入LB液體培養基200μl，于37℃緩搖孵育45min；⑸ 將培養物適量涂于1.5%瓊脂LB
目的基因的亞克隆3
2． 調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進入循環擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環30-35次，最后在72℃ 保溫7min。3． 結束反應，PCR產物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。4．PC
目的基因的亞克隆（subcloning）2
四、連接產物的轉化1.感受態細胞的制備⑴ 保存于-70℃的DH5α（或其他菌種）用接種環劃菌于1.5%瓊脂平板上，37℃恒溫倒置培養至單菌落出現（約14-16 hr）。⑵ 挑取單菌落，接種于2.0ml LB液體培養基中，37℃恒溫，250g振蕩培養過夜（約12hr）。⑶ 取0.5ml 過夜培養液，接
目的基因的亞克隆（subcloning）1
所謂亞克隆就是對已經獲得的目的片段進行重新，其目的在于對目的進行進一步分析，或者進行重組改造等。亞的基本過程包括：(1)目的片段和載體的制備； (2)目的片段和載體的連接；(3)連接產物的轉化；(4)重組子篩選。一、試劑準備1．LB液體培養基：胰化蛋白胨（細菌培養用）10g，酵母提取物（細菌培養用）
目的基因的PCR克隆的原理（二）
此酶具有以下特點： （1）耐高溫，在70℃下反應2小時后其殘留活性在90%以上，在93℃下反應2小時后其殘留活性是仍能保持60%，而在95℃ 下反應2小時后為原來的40%。 （2）在熱變性時不會被鈍化，故不必在擴增反應的每輪循環完成后再加新酶。 （3）一般擴增的PCR產物長度可達2.0
目的基因的PCR克隆的原理（一）
1實驗原理 1.1聚合酶鏈式反應（PCR）的基本構成 PCR指在引物指導下由酶催化的對特定模板（克隆或基因組DNA）的擴增反應，是模擬體內DNA復制過程，在體外特異性擴增DNA片段的一種技術，在分子生物學中有廣泛的應用，包括用于DNA作圖、 DNA測序、分子系統遺傳學等。 PCR基本原理
原核表達之目的基因克隆
1. 了解實驗課題對目的蛋白的要求包括：目的蛋白分子量有多大，表達目的（是蛋白結晶、藥劑結合還是制備抗體，不同目的對蛋白要求不同）；是否要其可溶；是胞內表達還是分泌表達，是組成型表達還是誘導型表達；另外，還要了解蛋白表達后需要采用什么樣的方式進行純化，純化標簽有多大，蛋白純化后是否需要將標簽去除（即
PCR技術目的基因的直接克隆介紹
與常規的基因克隆方法相比，PCR的優點是快速，簡單，但是用PCR克隆目的基因的限制是必須知道側接靶序列的核苷酸序列，以制備引物。因而該法具有很大的局限性。 可直接利用具有平端的PCR產物進行克隆，但利用合適的引物，在待克隆的目的基因二側引入不同的限制性酶切點，則可將擴增之后的目的基因定向克隆到
常用的植物目的基因克隆技術
1、通過已知基因產物的分析和鑒定這類技術主要通過生物化學和病理學研究分離鑒定有關基因的蛋白產物，并對蛋白質氨基酸順序進行分析，推斷出編碼該蛋白質的基因序列，然后通過抗體、寡聚核苷酸探針或PCR制備的探針對文庫進行篩選來分離目的基因。如植物抗病蟲基因工程中常用的蘇云金桿菌殺蟲晶體蛋白基因（Bt基因）、
目的基因片段的PCR擴增與克隆
1.PCR技術 PolymeraseChainReaction聚合酶鏈反應它是一種模擬天然DNA復制過程，在有DNA模板、DNA聚合酶（Taq酶）、RNA引物和四種dNTP的情況下，通過高溫變性（90℃－95℃，1－2min）,低溫退火（25℃－37℃，1－2min）,中溫延伸（60℃－75℃，90
亞克隆的定義
從一個克隆的DNA片段上分割幾個區域，分別將之克隆到新的載體上，獲得一系列新的重組子。
亞克隆的技術特點
亞克隆技術：限制性內切酶是一類能識別雙鏈DNA分子中特異核苷酸序列的DNA水解酶，該類酶是體外剪切基因片段的重要工具。
亞克隆的基本過程
亞克隆的基本過程包括：(1)目的DNA片段和載體的制備；(2)目的DNA片段和載體的連接；(3)連接產物的轉化；(4)重組子篩選。
亞克隆技術
一、目的與原理限制性內切酶是一類能識別雙鏈DNA分子中特異核苷酸序列的DNA水解酶，該類酶是體外剪切基因片段的重要工具。實驗主要通過EcoR Ⅰ,Hind Ⅲ兩種限制性內切酶對λ DNA的單切酶、雙切酶及部分酶切的操作，掌握內切酶的實驗操作技術。二、材料與試劑1．材料：λDNA2．儀器：離心機，恒溫
DNA片段的亞克隆實驗
實驗材料 DNA試劑、試劑盒 CIPdNTPDNA聚合酶T4聚合酶DTTATP儀器、耗材 水浴鍋電泳儀培養箱實驗步驟 1. ?在20 μl 反應體積內用合適的酶完全消化DNA。75℃加熱15 min，滅活酶。如若無需進一步的酶促處理，接歩驟6。2. ?如果5’磷酸需要去除，加入2 μl 10×CIP
DNA片段的亞克隆實驗
基本方案 凝膠塊中DNA連接 ? ? ? ? ? ? 實驗材料 DNA 試劑、試劑盒
基因克隆
外源DNA和質粒載體的連接反應?外源ＤＮＡ片段和線狀質粒載體的連接，也就是在雙鏈ＤＮＡ５'磷酸和相鄰的3'羥基之間?形成的新的共價鏈。如質粒載體的兩條鏈都帶5'磷酸，可生成４個新的磷酸二酯鏈。但如果質粒ＤＮＡ已去磷酸化，則吸能形成２個新的磷酸二酯鏈。在這種情況下產生的兩個雜交
含有目的基因真核表達－pEGFPC1載體的構建實驗_克隆法
實驗方法原理在設計引物時,一對引物兩端分別加了兩個酶切位點,這兩個酶切位點與pEGFP-C1 載體多克隆位點中的酶切位點相吻合,且位置和方向都合適。這樣, 目的基因片段和pEGFP-C1 載體經雙酶切后,由于酶切位點一致,在T4 DNA 連接酶的作用下就可以連接。實驗材料DNA 片段試劑、試劑盒pE
基因的圖位克隆
?圖位克隆(Ｍａｐ-ｂａｓｅｄｃｌｏｎｉｎｇ)又稱定位克隆(ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｃｌｏｎｉｎｇ),1986年首先由劍橋大學的Ａｌａｎｃｏｕｌｓｏｎ提出,用該方法分離基因是根據目的基因在染色體上的位置進行的,無需預先知道基因的ＤＮＡ順序,也無需預先知道其表達產物的有關信息,但應有以下兩方面的基本情況:
iPCR或混合PCR產物的SLIC亞克隆
實驗概要SLIC（Sequence and Ligation Independent Cloning）是一種不依賴于基因序列和連接反應的高效基因克隆新方法，它可以實現體外同源重組反應中多個DNA片段在單一反應中的裝配和單鏈的退火。實驗步驟1. 用限制性內切酶處理2微克載體，使用QIAEX II凝膠提
DNA片段的亞克隆實驗——基本方案
所謂亞克隆就是對已經獲得的目的DNA片段進行重新克隆，其目的在于對目的DNA進行進一步分析，或者進行重組改造等。亞克隆的基本過程包括：(1)目的DNA片段和載體的制備；(2)目的DNA片段和載體的連接；(3)連接產物的轉化；(4)重組子篩選。實驗材料DNA試劑、試劑盒CIPdNTPDNA聚合酶T4聚
標記基因和目的基因的區別
目的基因是需要表達的基因,標記基因是有一定特點的基因當人們想利用某些細菌產生某些物質時,會先提取目的基因,然后讓目的基因與運載體結合,再將目的基因導入受體細胞,最后培養細胞進行表達.標記基因就是在導入受體細胞時導入進取的人類的已知作用的基因,目的是為檢測目的基因是否成功導入.由于一般都是有"鳥槍法"
用核酸內切酶構建亞克隆
實驗概要所謂亞克隆就是對已經獲得的目的DNA片段進行重新克隆，其目的在于對目的DNA進行進一步分析，或者進行重組改造等。亞克隆的基本過程包括：(1)目的DNA片段和載體的制備；(2)目的DNA片段和載體的連接；(3)連接產物的轉化；(4)重組子篩選。主要試劑1．LB液體培養基：胰化蛋白胨（細菌培養用
目的基因獲取的方法
目的基因的獲取方法主要有以下2類（1）已知基因的獲得 PCR分離法和化學合成法等（2）未知基因的獲得 直接分離法和基因文庫分離法等直接分離法1、限制性內切酶法用限制性內切酶把基因組DNA切成不同大小的片斷應用對象 適合于從簡單的基因組中分離目的基因 如質粒或病毒的大小只有幾千堿基 大的也超不過幾十萬