Western實驗中內參基因的選擇及使用方法
Western Blot實驗常用于檢測蛋白表達量、蛋白表達產物的正確性等。相對于其他檢測蛋白的方法而言Western Blot實驗在蛋白的定性定量分析、與目的蛋白量的比較方面更簡單一些。雖然，順利的時候Western blot做起來很簡單，可不順的時候也很令人心煩――做不出結果啦、假陽性啦、結果出現多條帶啦、抗體問題啦（一抗有問題還是二抗有問題啦）……畢竟，作為一種有活性的生物大分子，抗體和抗原的反應不象1+1那么明確，而用這種不確定的試劑來測定同樣知之甚少的表達產物，確實是有一定的不確定性的。所以，嚴謹的 Western Blot實驗設計中要求有良好的參照體系，對實驗結果分析是非常有用。特別是當實驗出現問題時，借助參照體系很容易就可以查出問題所在，而不必抓耳撓腮怨天尤人。良好的參照體系通常包括分子量marker(用來確定蛋白條帶對應的分子量大小)、空白載體對照 (如果是誘導表達體系還應該有誘導前的對照)、已知量標準......閱讀全文
內參基因與目的基因的Ct值相差很大
不同基因之間表達量差異很大，可達上千甚至上萬倍之差，所以CT值差10以內屬正常現象，但通常選用內參基因屬于表達量較高的持家基因，如果目標基因和內存基因表達量（CT值差）過大，用內參基因來衡量目標基因的表達量（絕對值）就不完全可靠，但至少可以說明目標基因表達非常低。
Western－Blot實驗（二）
小巧的體格，卻一應俱全，可以靈活控制多種應用程序，包括化學發光，熒光，DNA/蛋白膠。可以滿足對實驗室各種樣品成像的要求。是目前市面上唯一的一款既可進行Cy3, Cy5, Cy2 多色熒光LED成像，又可在700和800nm處進行近紅外激光定量熒光western 成像系統。這達到對成像最完美
Western－Blot實驗步驟
實驗步驟： 1.分別配制 5%濃縮膠和12%分離膠 12%分離膠10mL 5%積層膠6mL H2O 3.3mL H2O 4.20mL 30% Acrylamide 4mL 30% Acrylamide 1mL pH8.8 Tris HCl（1.5M） 2.5mL PH6.8Tris
Western－Blot實驗（一）
大家都知道Western Blot時間周期較長，大致可以分為忙碌的第一天，和心痛的第二天，像極了愛情。人生若只如初見，何事秋風悲畫扇。經歷轉瞬即逝的新手曙光后，便進入漫長的黑夜。第一天，從最一步的配膠，到最后一步的孵育膜都極細心像極了愛情的萌芽期，需要精心的呵護。第二天經過繁瑣的洗膜，孵二抗，洗膜，
常用的內參基因及其使用范圍
內參即是內部參照，它們在各組織和細胞中的表達相對恒定，在檢測基因的表達水平變化時常用它來做參照物 你可以去生物幫那里了解這方面的信息，那兒技術文檔、視頻資源豐富，我很喜歡到那里找想要的東西，而且還有很多軟件可以下載，并且有軟件的教材。有時間可以去看看。 包括GAPDH 、β- actin(BETA-
Western－Blot常見問題總結
Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與或標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電
怎么選擇適合的GAPDH內參抗體？
在Western Bloting實驗中，在遇到總蛋白濃度測定不準確時候，或者蛋白質樣品在電泳前上樣時產生的樣品間的操作存在誤差；這些誤差可以通過測定每個樣品中實際轉到膜上的內參,比如內參GAPDH的含量來進行校正。??GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）是參與糖酵解的一種關鍵酶，由4個30-40kD
Western－Blot技術實驗流程
Western Blot又稱為蛋白質印跡，是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的基于抗體抗原之間特異免疫反應的一種定量或定性檢測蛋白的實驗方法。基本原理：聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同分子量的蛋白質樣品分離，分離后的蛋白被轉移到固相支撐物（雜交膜）上，抗體特異性識別目標蛋白，通過酶促反應或者化學發光等
Western－Blot實驗關鍵
Western Blot操作步驟多，每一步的失誤都會造成全盤失敗，綜合而言，抗體仍然是決定成敗的關鍵，如果抗體不好，就是神仙也沒招。其中內參抗體很重要，因為內參抗體的選擇關系到全盤實驗的考評。Actin，Tubulin，GAPDH我們都用過，Actin，Tubulin的缺點是有時候會出現復帶，比較穩
western－blot的實驗原理
蛋白免疫印跡（Western blotting 或 Immunoblotting）一般由凝膠電泳、樣品的印跡和免疫學檢測三個部分組成。第一步是做 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，使待測樣品中的蛋白質按分子量大小在凝膠中分成帶。第二步把凝膠中已分成條帶的蛋白質轉移到一種固相支持物上， 用得最多的材料是硝酸
western－blot的實驗原理
Western Blot與Southern印跡雜交或Northern印跡雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經過PAGE分離的蛋白質樣品(跑PAGE 膠的原理你懂吧~~~)，轉移到固相載體（硝酸纖維素膜NC膜）上
westernblot實驗過程
Western，也稱Western blot、Western blotting、Western印跡，是用抗體檢測蛋白的重要方法之一。可按照以下步驟操作。1.收集蛋白樣品(Protein sample preparation)使用細胞裂解液，對貼壁細胞、懸浮細胞或組織樣品進行裂解。然后測定每個蛋白樣品
Western－Blot技術實驗流程
Western Blot又稱為蛋白質印跡，是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的基于抗體抗原之間特異免疫反應的一種定量或定性檢測蛋白的實驗方法。 基本原理：聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同分子量的蛋白質樣品分離，分離后的蛋白被轉移到固相支撐物（雜交膜）上，抗體特異性識別目標蛋白，通過酶促反應或
Western－Blot－Protocol實驗步驟
一、提取抗原蛋白??將提取RNA途中留存的樣品，加入150μl100%酒精充分混勻，靜置5min(RT),2000×g,4℃離心5min,吸取上清至新管中,加入750μl異丙醇,混勻,靜置10min(RT),12000×g,4℃離心10min,棄上清,加入1ml0.3mol/L鹽酸胍/95%酒精重懸
如何選一個好的內參基因
好的內參基因應該受環境影響變化較小，否則不能作為對照與處理的內參。常用內參有actin，ubiquitin，histone等等，一般物種都有常用內參，不建議在這方面發揮。
總蛋白儀與內參的可靠性比較
目前，多個主流期刊和免疫印跡專家提出了看家基因已經不適合作為內參使用了。因為大多數看家基因都是高豐度蛋白，其產生的信號大多都會接近線性動態范圍的上限，當我們在檢測低豐度蛋白的時候，往往蛋白的上樣量會很大，易造成信號過飽和，這時候常見的內參產生的信號已經不能正確反應上樣量的差異了。并且研究發現一些看家
Western免疫印跡（Western－Blot）實驗原理和主要試劑
Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產物，可通過融合部分的抗體檢測。實驗原理與Southern或 Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電
集胞藻PCC6803蛋白抗體分類及功能
PHYTOAB公司開發了集胞藻PCC6803蛋白抗體，產品網址鏈接：http://www.phytoab.com/products/algae-antibodies/cyanobacteria聯系電話：400-810-0506PHYTOAB是一家專門從事植物抗體生產和定制服務的企業，總部位于美國加利
線粒體內參抗體—克隆號為14Y2的COX－IV單克隆抗體
細胞色素c氧化酶(Cytochrome c oxidase，簡稱COX)是一種異源寡聚酶，通常含有13個亞基，定位于線粒體內膜，是線粒體呼吸鏈的酶復合物。細胞色素c氧化酶中形成催化中心的3個最大的亞基由線粒體DNA編碼，其余10個亞基包括COX IV由細胞核內的基因組DNA編碼。細胞色素
Western－Blotting,實驗標本處理
抗體和樣品要求1.為保證質量，抗體最好為進口單克隆抗體；2.樣本要求：盡可能新鮮；3.?樣本量：組織樣本，質量大于100mg；細胞樣本，細胞數大于1×106；注意事項：1.市內細胞樣品可直接常溫運送，運送時在培養瓶中裝滿培養液并以封口膜封口，建議凍存后運輸。2.取樣和存樣所用的凍存管、離心管、吸頭等
Western－Blot－Protocol實驗操作步驟
一、提取抗原蛋白 將提取RNA途中留存的樣品，加入150μl100%酒精充分混勻，靜置 ?5min(RT),2000×g,4℃離心5min,吸取上清至新管中,加入750μl異丙醇,混勻,靜置10min(RT),12000×g,4℃離心 ?10min,棄上清,加入1ml0.3mol/L鹽酸胍/95%酒
western－blot實驗結果怎么分析
灰度掃描目標條帶，與內參條帶灰度值比較，進行標準化數據。根據比值繪制圖表。IP=immunoprecipitation 免疫沉淀（富集樣品或避免抗體同原材料中其他物質發生非特異反應）IB=immunoblotting 免疫印跡 （不一定是蛋白免疫印跡=Western blotting）
realtime－PCR中內參基因的CT值
這個要看你在做PCR前的加樣量是否一致。如果加樣量是一致的，而內參做出來差別大（比如3-4個CT值）那說明你的實驗體系有嚴重的問題。理論上加入的DNA量一樣多，內參的CT值應該都一樣。如果你能肯定加樣量是一致的，那說明你的樣本要么降解了，要么就是你的實驗處理對內參的量產生了影響，必須換一個基因做內參
realtime－PCR中內參基因的CT值
這個要看你在做PCR前的加樣量是否一致。如果加樣量是一致的，而內參做出來差別大（比如3-4個CT值）那說明你的實驗體系有嚴重的問題。理論上加入的DNA量一樣多，內參的CT值應該都一樣。如果你能肯定加樣量是一致的，那說明你的樣本要么降解了，要么就是你的實驗處理對內參的量產生了影響，必須換一個基因做內參
realtime－PCR中內參基因的CT值
這個要看你在做PCR前的加樣量是否一致。如果加樣量是一致的，而內參做出來差別大（比如3-4個CT值）那說明你的實驗體系有嚴重的問題。理論上加入的DNA量一樣多，內參的CT值應該都一樣。如果你能肯定加樣量是一致的，那說明你的樣本要么降解了，要么就是你的實驗處理對內參的量產生了影響，必須換一個基因做內參
realtime－PCR中內參基因的CT值
這個要看你在做PCR前的加樣量是否一致。如果加樣量是一致的，而內參做出來差別大（比如3-4個CT值）那說明你的實驗體系有嚴重的問題。理論上加入的DNA量一樣多，內參的CT值應該都一樣。如果你能肯定加樣量是一致的，那說明你的樣本要么降解了，要么就是你的實驗處理對內參的量產生了影響，必須換一個基因做內參
realtime－PCR中內參基因的CT值
這個要看你在做PCR前的加樣量是否一致。如果加樣量是一致的，而內參做出來差別大（比如3-4個CT值）那說明你的實驗體系有嚴重的問題。理論上加入的DNA量一樣多，內參的CT值應該都一樣。如果你能肯定加樣量是一致的，那說明你的樣本要么降解了，要么就是你的實驗處理對內參的量產生了影響，必須換一個基因做內參
realtime－PCR中內參基因的CT值
這個要看你在做PCR前的加樣量是否一致。如果加樣量是一致的，而內參做出來差別大（比如3-4個CT值）那說明你的實驗體系有嚴重的問題。理論上加入的DNA量一樣多，內參的CT值應該都一樣。如果你能肯定加樣量是一致的，那說明你的樣本要么降解了，要么就是你的實驗處理對內參的量產生了影響，必須換一個基因做內參
realtime－PCR中內參基因的CT值
這個要看你在做PCR前的加樣量是否一致。如果加樣量是一致的，而內參做出來差別大（比如3-4個CT值）那說明你的實驗體系有嚴重的問題。理論上加入的DNA量一樣多，內參的CT值應該都一樣。如果你能肯定加樣量是一致的，那說明你的樣本要么降解了，要么就是你的實驗處理對內參的量產生了影響，必須換一個基因做內參
realtime－PCR中內參基因的CT值
這個要看你在做PCR前的加樣量是否一致。如果加樣量是一致的，而內參做出來差別大（比如3-4個CT值）那說明你的實驗體系有嚴重的問題。理論上加入的DNA量一樣多，內參的CT值應該都一樣。如果你能肯定加樣量是一致的，那說明你的樣本要么降解了，要么就是你的實驗處理對內參的量產生了影響，必須換一個基因做內參