分子生物學相關實驗步驟及注意事項（一）
剛進實驗室的小伙伴們，當你們在進行RNA的提取，RT-PCR和QPCR實驗時，是否會有這樣的感受，明明是按照實驗步驟往下做的，實驗結果卻不如人意，甚至很糟糕呢？小編我也曾經被實驗狠狠地虐過呢~為了減少實驗對親們的打擊，在此獻上自己在實驗過程中的一些小經驗，希望能幫助到各位小伙伴們~（一）RNA提取篇在RNA提取過程中，嚴格防止RNA酶的污染，并設法抑制其活性，這是本實驗成功的關鍵。對于人、動植物組織、細菌、細胞等多種RNA的提取，Trizol法效果良好，可同時分離一個樣品內的RNA/DNA/蛋白質。Trizol裂解細胞，溶解細胞內含物，同時因含有RNase抑制劑可保持RNA的完整性。如果對RNA純度要求極高或者樣品難以提取，也可以選擇使用RNA提取試劑盒。有同學用過國內的天根，效果還好。小編曾用過Omega的RNA提取試劑盒，效果也挺好的，Promega的總RNA提取試劑盒對多種樣本的小量純化提取效果也還不錯。動植物總RNA提取......閱讀全文
分子生物學標準化現狀
基因技術可給人類巨大的利益，但也給醫學、倫理、法律和經濟帶來巨大沖擊。基因檢驗濫用造成了資源浪費及不必要的醫療糾紛，基因隱私導致用人和保險歧視，但限制基因檢驗又對基因檢驗技術的發展造成負面影響。 美國衛生部(DHHS)為解決對基因檢驗安全和有效性的評估及了解有無必要進行更多的監督和管理。于19
分子生物學常用實驗技術（十八）
五、操作步驟：（一）、模板制備1、M13 單鏈模板制備：在轉化入合適的大腸桿菌宿主菌且在含有指示劑如X-gal/IPTG 的培養基上鋪板之后, 含有M13 重組子的細胞將表現出無色的"噬菌斑"，事實上受感染的細胞并非被噬菌體溶菌或殺死，出現噬菌斑是因為被感染的細菌在生長速度上比其周圍未感染的
分子生物學常用實驗技術（十一）
第八章聚合酶鏈式反應(PCR)擴增和擴增產物克隆第一節概述 PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈反應)是一種選擇性體外擴增DNA 或RNA 的方法.它包括三個基本步驟: (1) 變性(Denature):目的雙鏈DNA 片段在94℃下解鏈; (2) 退火
分子生物學課程教學講義（一）
第一講 序論 二、現代分子生物學中的主要里程碑 分子生物學是研究核酸、蛋白質等所有生物大分子的形態、結構特征及其重要性、規律性和相互關系的科學，是人類從分子水平上真正揭開生物世界的奧秘，由被動地適應自然界轉向主動地改造和重組自然界的基礎學科。當人們意識到同一生物不同世代之間的連續性是由生物體自身所
分子生物學分型法有哪些？
（一）RFLP與PCR－RFLP分型法?限制性片段長度多態性（RFLP）分析，稱為DNA－RFLP。DNA片段進行體外擴增，然后再用限制性內切酶進行酶切分析，可使限制性長度分析的敏感度增加，此類方法稱為PCR-RFLP分型法。PCR－RFLP分型法所應用的PCR引物為HLA組特異性的，此法特別適應于
豬丹毒分子生物學診斷技術
? 常規細菌培養檢測豬丹毒至少要3天，鑒定血清型大約要lo天，而這種PCR法可在5h內完成。它使用兩步擴增法，先用高度特異性引物組M0101-M0102進行初步擴增之后，再添加4種特異性寡核苷酸引物組對4種不同血清型豬丹毒的16SrRNA序列進行擴增。???? rRNA基因簇包括16SrRNA、23
分子生物學實驗診斷技術（二）
（三）Northern blot用于RNA分析，電泳條件與轉膜方法與Southern blot不同外，RNA不必變性與中和，電泳時加電醛防止RNA發夾結構形成。其它步驟相同。為了防止RNase水解需分析的mRNA，盡可能將器皿在160-180℃干熱滅菌8小時以上，也可加0.1％焦碳酸二乙酯（DEPC
分子生物學常用實驗技術（二）
第三節操作步驟 一、細菌的培養和收集 將含有質粒pBS 的DH5α菌種接種在LB 固體培養基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培養12-24 小時。用無菌牙簽挑取單菌落接種到5ml LB 液體培養基(含50μg/ml Amp)中,37℃振蕩培養約12 小時至對數生長后期。 二、質粒D
分子生物學常用實驗技術（五）
第四章RNA 的提取和cDNA 合成 第一節概述 從真核生物的組織或細胞中提取mRNA,通過酶促反應逆轉錄合成cDNA 的第一鏈和第二鏈,將雙鏈cDNA 和載體連接,然后轉化擴增, 即可獲得cDNA 文庫,構建的cDNA 文庫可用于真核生物基因的結構、表達和調控的分析;比較cDNA 和相
分子生物學常用實驗技術（七）
（四） 電泳分析 通常合成的cDNA 第一鏈和第二鏈長度為350-6000 堿基,需進行1.4%堿性瓊脂糖電泳。將第一鏈和第二鏈摻入測定管中的反應液先用酚抽提,乙醇沉淀，方法見本章（二）第二鏈合成中的9-12 步，一般第一鏈和第二鏈上樣量相同。1. 標準分子量DNA 參照物的同位素標記(1) 通常
分子生物學常用實驗技術（十三）
2. 從RNA 合成單鏈cDNA 探針cDNA 單鏈探針主要用來分離cDNA 文庫中相應的基因。用RNA為模板合成cDNA 探針所用的引物有兩種: (1)用寡聚dT 為引物合成cDNA 探針。本方法只能用于帶Poly(A)的mRNA,并且產生的探針極大多數偏向于mRNA 3'末端序列
分子生物學常用實驗技術（九）
第三節從動物組織提取基因組DNA一、材料 哺乳動物新鮮組織。二、設備 移液管、高速冷凍離心機、臺式離心機、水浴鍋。三、試劑1、分離緩沖液：10mmol/L Tris?Cl pH7.4, 10mmol/L NaCl, 25mmol/L EDTA。2、其它試劑：10% SDS，蛋白酶K (20mg/
分子生物學實驗常用試劑配置
一. 常用貯液與溶液?1mol/L亞精胺（Spermidine）: 溶解2.55g亞精胺于足量的水中，使終體積為10ml。分裝成小份貯存于-20℃。?1mol/L精胺（Spermine）：溶解3.48g精胺于足量的水中，使終體積為10ml。分裝成小份貯存于-20℃。?10mol/L乙酸胺（ammon
分子生物學常用實驗技術（十七）
第二節T7 DN A 聚合酶測序技術一、概述 T7 DNA 聚合酶最初具有5'→3'聚合酶活性以及單鏈和雙鏈3'→5'外切酶活性。當T7 DNA 聚合酶用適當方法處理后，可使3'→5'外切酶活力明顯下降。改造后的T7 DNA 聚合酶又稱T7
分子生物學課程教學講義（二）
第二講 染色體與DNA一、 DNA的組成與結構 Avery在1944年的研究報告中寫道："當溶液中酒精的體積達到9/10時，有纖維狀物質析出。如稍加攪拌，它就會象棉線在線軸上一樣繞在硬棒上，溶液中的其它成份則呈顆粒狀沉淀。溶解纖維狀物質并重復數次，可提高其純度。這一物質具有很強的生物學活性，初步實驗
分子生物學常用實驗技術（六）
一、材料 提純TMV 病毒液（10mg/ml）。二、設備 冷凍臺式離心機，低溫真空干燥儀，電泳儀，電泳槽。三、試劑 TE-飽和酚:氯仿（1:1），氯仿，3M NaAc(pH5.2)，乙醇(100%和70%)，TE 緩沖液，無RNA 酶的雙菌水。四、操作步驟1、取一eppendorf 管加入提純
分子生物學常用實驗技術（十六）
（三）電泳：1、預電泳（1）當凝膠聚合完全后，撥出鯊魚齒梳，將該梳子反過來，把有齒的一頭插入凝膠中，形成加樣孔。（2）立即將膠板固定在測序凝膠槽中，一般測序凝膠槽的上下槽是分開的，因而只有在固定好凝膠板后，方能加入TBE 緩沖液。（3）稀釋10×TBE 緩沖液至1×TBE，將該緩沖液加入上下二個電泳
分子生物學常用試劑的配制
1．LB(Luria-Bertani)培養液、平板的配制配制每升LB培養液，應在950ml去離子水中加入：細菌培養用酵母提取物（bacto-yeastextract）5g細菌培養用胰化蛋白胨（bacto-tryptone）10gNaCl10g搖動容器直至溶質完全溶解，用5mol/LNaOH(約0.2
分子生物學常用實驗技術（十二）
第九章分子雜交技術 互補的核苷酸序列通過Walson-Crick 堿基配對形成穩定的雜合雙鏈分子DNA 分子的過程稱為雜交。雜交過程是高度特異性的,可以根據所使用的探針已知序列進行特異性的靶序列檢測。雜交的雙方是所使用探針和要檢測的核酸。該檢測對象可以是克隆化的基因組DNA,也可以是細胞總D
分子生物學常用實驗技術（一）
第一章質粒DNA 的分離、純化和鑒定第二章DNA 酶切及凝膠電泳第三章大腸桿菌感受態細胞的制備和轉化第四章RNA 的提取和cDNA 合成第五章重組質粒的連接、轉化及篩選第六章基因組DNA 的提取第七章RFLP 和RAPD 技術第八章聚合酶鏈式反應(PCR)擴增和擴增產物克隆第九章分子雜交技術第十章測
分子生物學常用實驗技術（十）
第二節RFLP 技術一、材料 基因組DNA(大于50kb,分別來自不同的材料)。二、設備 電泳儀及電泳槽， 照相用塑料盆5 只，玻璃或塑料板(比膠塊略大) 4 塊，吸水紙若干，尼龍膜(依膠大小而定)，濾紙，eppendorf 管(0.5ml)若干。三、試劑：1、限制性內切酶(BamHⅠ, Ec
分子生物學常用實驗技術（十五）
第十章測序技術 在分子生物學研究中，DNA 的序列分析是進一步研究和改造目的基因的基礎。目前用于測序的技術主要有Sanger 等（1977）發明的雙脫氧鏈末端終止法和Maxam 和Gilbert（1977）發明的化學降解法。這二種方法在原理上差異很大，但都是根據核苷酸在某一固定的點開始，隨
分子生物學實驗常用試劑配置
常用貯液與溶液1mol/L亞精胺（Spermidine）: 溶解2.55g亞精胺于足量的水中，使終體積為10ml。分裝成小份貯存于-20℃。1mol/L精胺（Spermine）：溶解3.48g精胺于足量的水中，使終體積為10ml。分裝成小份貯存于-20℃。10mol/L乙酸胺（ammonium ac
分子生物學常用實驗技術（十四）
三、菌落原位雜交 對分散在若干個瓊脂平板上的少數菌落（100-200）進行克隆篩選時，可采用本方法。將這些菌落歸并到一個瓊脂主平板以及已置于第二個瓊脂平板表面的一張硝酸纖維素濾膜上。經培養一段時間后，對菌落進行原位裂解。主平板應貯存于4℃直至得到篩選結果。1、材料：待檢測的細菌平皿，已標記好的探針
最前沿的分子生物學技術
自然科學的發展從20世紀以來有過兩次重大變革,第一次是在物理學領域,它不僅全面推動了自然科學的發展,所引起的技術革命也已經給人類生活帶來了巨大影響。第二次變革發生在生物學領域,是由于物理學和化學廣泛而又深刻地滲入生物學的結果。這次變革以50年代中脫氧核糖核酸(DNA)雙螺旋結構的確定和蛋白質晶體結構
分子生物學課程教學講義（四）
第四講 DNA、RNA和蛋白質代謝 DNA是貯藏遺傳信息的最重要的生物大分子。DNA分子中的核苷酸排列順序不但決定了胞內所有RNA及蛋白質的基本結構，還通過蛋白質（酶）的功能間接控制了細胞內全部有效成份的生產、運轉和功能發揮。貯藏在任何基因中的生物信息都必須首先被轉錄生成RNA，才能夠得到表達。D
分子生物學實驗診斷技術（一）
一、核酸雜交技術????? ? 檢驗方法建立的基本要素是特異性和靈敏度，在復雜的物體中，使無法感覺的特定物質進入人類的觀察范圍。核酸雜交檢測技術就是利用核酸堿基嚴格配對的特異性，核酸標記物的靈敏度而建立的檢測核酸結構與功能的方法。該法建立以來已有二十年，目前研究實驗室用得多，臨床實驗室用得較少，除成
分子生物學實驗常用試劑配置
一. 常用貯液與溶液 1mol/L亞精胺（Spermidine）: 溶解2.55g亞精胺于足量的水中，使終體積為10ml。分裝成小份貯存于-20℃。 1mol/L精胺（Spermine）：溶解3.48g精胺于足量的水中，使終體積為10ml。分裝成小份貯存于-20℃。 10mol/L乙酸胺（ammo
分子生物學常用實驗技術（三）
第二章DNA 酶切及凝膠電泳第一節概述一. DNA 的限制性內切酶酶切分析 限制性內切酶能特異地結合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA 序列之內或其附近的特異位點上,并切割雙鏈DNA。它可分為三類:Ⅰ類和Ⅲ類酶在同一蛋白質分子中兼有切割和修飾(甲基化)作用且依賴于ATP 的存在。Ⅰ類酶結
分子生物學常用實驗技術（四）
第三章大腸桿菌感受態細胞的制備和轉化第一節概述 在自然條件下,很多質粒都可通過細菌接合作用轉移到新的宿主內,但在人工構建的質粒載體中,一般缺乏此種轉移所必需的mob 基因,因此不能自行完成從一個細胞到另一個細胞的接合轉移。如需將質粒載體轉移進受體細菌，需誘導受體細菌產生一種短暫的感受態以攝取外