λ噬菌體載體DNA的堿性磷酸酶處理實驗
實驗方法原理 λ 噬菌體兩臂內部末端 5'-磷酸基團的去除，能有效防止自連和減少非重組噬菌體的背景。當使用含單一克隆位點的插入型載體（如 λgt10、λgt11 和 λORF8）或使用雖含多克隆位點但用單一酶切割的插入型載體（如 λgt18-23 和 λZAP) 時，本方法可被用于抑制非重組子背景。實驗材料 噬菌體 T4 DNA 連接酶牛小腸堿性磷酸酶去磷酸緩沖液蛋白酶 K限制性內切核酸酶λ 噬菌體 DNAλ 噬菌體包裝混合物試劑、試劑盒 λ 復性緩沖液氯仿EDTA乙醇酚：氯仿SDS乙酸鈉TETris-Cl儀器、耗材 狗腳指甲鉗水浴實驗步驟 一、材料1. 緩沖液和溶液(1) λ 復性緩沖液100 mmol/L Tris-Cl ( pH 7.6)10 mmol/L MgCl2(2) ATP ( 10 mmol/L)(3) 氯仿(4) EDTA ( 0.5 mmol/L，pH 8.0)(5) 乙醇(6) 酚：氯仿（1......閱讀全文
λ噬菌體載體DNA的堿性磷酸酶處理實驗
λ 噬菌體兩臂內部末端 5'-磷酸基團的去除，能有效防止自連和減少非重組噬菌體的背景。當使用含單一克隆位點的插入型載體（如 λgt10、λgt11 和 λORF8）或使用雖含多克隆位點但用單一酶切割的插入型載體（如 λgt18-23 和 λZAP) 時，本方法可被用于抑制非重組子背景。本實驗
λ噬菌體載體DNA的堿性磷酸酶處理實驗
實驗方法原理 λ 噬菌體兩臂內部末端 5'-磷酸基團的去除，能有效防止自連和減少非重組噬菌體的背景。當使用含單一克隆位點的插入型載體（如 λgt10、λgt11 和 λORF8）或使用雖含多克隆位點但用單一酶切割的插入型載體（如 λgt18-23 和 λZAP) 時，本方法可被用于抑
λ噬菌體載體DNA的堿性磷酸酶處理實驗
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 λ 噬菌體兩臂內部末端 5'-磷酸基團的去除，能有效防止自連和減少非重組噬菌體的背景。當使用含單一克隆位點的插入型載體（如 λgt10、λgt11 和 λORF8）或使用雖含多克隆位點但用單一酶切割的插入型載體（如
λ噬菌體的載體表達實驗
實驗材料 表達載體試劑、試劑盒 SDSLB儀器、耗材 培養箱分光光度計離心機實驗步驟 1. ?將表達載體轉化攜有溫度敏感突變的抑制基因的大腸桿菌溶源菌。轉化物涂布于LB/抗生素平皿上，32℃下溫育。2. ?于抗生素培養基中，32℃培養轉化菌。?3. ?以≥1：20的比例將過夜培養物稀釋往新鮮的LB/
λ噬菌體的載體表達實驗
基本方案1 基本方案2 ? ? ? ? ? ? 實驗材料 表達載體 試劑、試劑盒
λ噬菌體的載體表達實驗1
pSKF是利用了λ噬菌體的調節信號的pBR222衍生質粒。λ噬菌體阻遏蛋白cI 可完全抑制PL。啟動子的轉錄，使得含PL啟動子的質粒可穩定存在于宿主菌中。實驗材料表達載體試劑、試劑盒SDSLB儀器、耗材培養箱分光光度計離心機實驗步驟1. ?將表達載體轉化攜有溫度敏感突變的抑制基因的大腸桿菌溶源菌。轉
λ噬菌體的載體表達實驗2
實驗材料表達載體試劑、試劑盒SDSLB儀器、耗材培養箱分光光度計離心機實驗步驟1. ?將表達載體轉化一種復制缺陷型的大腸桿菌cI+溶源菌。轉化物涂布于LB/抗生素平皿上并于37℃下溫育。??2. ?在LB/抗生素培養基中，37℃過夜培養轉化細胞。?3. ?以≥1：20的比例將過夜培養物稀釋于新鮮的L
經雙限制酶切割用作克隆載體的λ噬菌體DNA的制備實驗
置換型載體（如 λ2001、λDASH、EMBL 系列、Charon 34、Charon 35 和 Charon 40 ) 含有一系列的限制位點，它們在中央填充片段的兩端以相反方向排列（Frischaufet al. 1983）。本實驗來源「分子克隆實驗指南第三版」黃培堂等譯。實驗方法原理置換型載體
經雙限制酶切割用作克隆載體的λ噬菌體DNA的制備實驗
實驗方法原理 置換型載體（如 λ2001、λDASH、EMBL 系列、Charon 34、Charon 35 和 Charon 40 ) 含有一系列的限制位點，它們在中央填充片段的兩端以相反方向排列（Frischaufet al. 1983）。實驗材料 噬菌體 T4 DNA 連接酶限制性內切核酸酶λ
經雙限制酶切割用作克隆載體的λ噬菌體DNA的制備實驗
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 置換型載體（如 λ2001、λDASH、EMBL 系列、Charon 34、Charon 35 和 Charon 40 ) 含有一系列的限制位點，它們在中央填充片段的兩端以相反方向排列（Frischaufet al. 1983）
可被單一限制酶切割用作克隆載體的λ噬菌體DNA制備實驗
在某些情況下，制備好的 λ 噬菌體 DNA 經限制酶的簡單消化即可用于克隆。但只有當所用載體能用遺傳學方法篩選含有外源 DNA 序列的重組噬菌體時（如 EMBL 系列、λ2001、λDASH、λZAP、λgt10），這種方案才是可行的。因為在這種情況下，不必采取步驟來減少非重組噬菌體的形成。本實驗來
可被單一限制酶切割用作克隆載體的λ噬菌體DNA制備實驗
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 在某些情況下，制備好的 λ 噬菌體 DNA 經限制酶的簡單消化即可用于克隆。但只有當所用載體能用遺傳學方法篩選含有外源 DNA 序列的重組噬菌體時（如 EMBL 系列、λ2001、λDASH、λZAP、λgt10），這種
M13噬菌體衍生載體的制備實驗——載體衍生法
M13噬菌體是一種絲狀噬菌體，感染宿主后不裂解細菌細胞，只利用細胞內物質完成自身增殖，組裝成完整病毒顆粒后被宿主細胞分泌而出，宿主細胞仍能繼續生長分裂。為分子生物學中理想的質粒載體。基因間隔區的有些核苷酸序列即使發生突變、缺失活插入外源DNA片段，也不會影響M13DNA的復制，這為M13DNA構建克
M13噬菌體衍生載體的制備實驗
實驗材料?質粒試劑、試劑盒?YT培養基儀器、耗材?離心機分光光度計搖床實驗步驟 1.? 將來自一個單菌落的過夜培蕎新鮮菌液按1 ：50稀釋，在含有適當抗生素的2×YT培養液（1~5 ml）中，于37℃培養至OD600=0.1。2.? 按1，10，20，50 MOI感染細胞，于37℃劇烈振蕩下培養4.
M13噬菌體衍生載體的制備實驗
載體衍生法 ? ? ? ? ? ? 實驗材料 質粒 試劑、試劑盒
分子克隆實驗載體DNA的選擇
①質粒：質粒是細菌染色體外遺傳因子，DNA呈環狀，大小為1-200千堿基對(kb)。在細胞中以游離超螺旋狀存在，很容易制備。質粒DNA可通過轉化引入寄主菌。在細胞中有兩種狀態，一是“緊密型”；二是“松弛型”。此外還應具有分子量小，易轉化，有一至多個選擇標記的特點。質粒型載體一般只能攜帶10kb以下的
l噬菌體載體的類型
插入型 （Insertion vectors ）這種載體僅僅有一個可供外源DNA插入的克隆位點。如：λgt10 、 λgt11克隆能力小，不到10kb置換型 （Replacement vectors）這種載體具有兩個對應的酶切克隆位點，在兩個位點之間的λDNA區段是λ噬菌體的非必需序列，可以被外源插
篩選構建于λ噬菌體載體的表達文庫實驗
在典型的免疫篩選實驗中，λ噬菌體表達載體構建的文庫應鋪在不含異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG) 的大腸桿菌菌株的平板上。誘導物的缺少保證了噬菌斑順利形成前不產生對宿主有毒性的融合蛋白，2~4 h 后，將平板從 42°C 移到 37°C 以穩定溫度敏感型的所有融合蛋白。本實驗來源于分子克隆實驗指
篩選構建于λ噬菌體載體的表達文庫實驗
? ? ? ? ? ? 試劑、試劑盒 封閉緩沖液 氯仿 IPTG 抗原-抗體復合物檢測試劑 SM TNT 緩沖液 洗滌緩沖液 放射
噬菌體DNA在濾膜上的雜交實驗
通過用?32P 標記探針的原位雜交，可篩選攜帶有固定化 DNA 的濾膜，這些 DNA 來源于噬菌斑。該技術是強有力的、高度特異的和很靈敏的，能從數千個噬菌斑中鑒別出單一的重組子。本實驗來源「分子克隆實驗指南第三版」黃培堂等譯。實驗方法原理通過用?32P 標記探針的原位雜交，可篩選攜帶有固定化 DNA
噬菌體DNA在濾膜上的雜交實驗
實驗方法原理 通過用 32P 標記探針的原位雜交，可篩選攜帶有固定化 DNA 的濾膜，這些 DNA 來源于噬菌斑。該技術是強有力的、高度特異的和很靈敏的，能從數千個噬菌斑中鑒別出單一的重組子。實驗材料 噬菌體 DNA放射性標記探針試劑、試劑盒 氯仿預雜交液SMSSPE儀器、耗材 煮沸的水浴玻璃（Py
噬菌體DNA在濾膜上的雜交實驗
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 通過用 32P 標記探針的原位雜交，可篩選攜帶有固定化 DNA 的濾膜，這些 DNA 來源于噬菌斑。該技術是強有力的、高度特異的和很靈敏的，能從數千個噬菌斑中鑒別出單一的重組子。
關于λ類噬菌體載體的概述
構建λ噬菌體載體的基本原理是多余限制位點的刪除，按照這一基本原理構建的λ噬菌體的派生載體，可以歸納成兩種不同的類型：一種是插入型載體（insertionvectors），只具有一個可供外源DNA插入的克隆位點，另一種是替換型載體（rePlacementvectors），具有成對的克隆位點，在這兩
篩選構建于λ噬菌體載體的表達文庫實驗（一）
試劑、試劑盒 封閉緩沖液氯仿IPTG抗原-抗體復合物檢測試劑SMTNT 緩沖液洗滌緩沖液放射性碘標記第二抗體第一抗體LB 瓊脂板LB 頂層瓊脂板硝酸纖維素濾膜λ噬菌體表達文庫E.coli儀器、耗材 預設 42°C 的空氣培養箱培養管平頭鑷子裝有防水黑墨水（印度墨水）并帶有 18 號針頭的注射器實驗步
篩選構建于λ噬菌體載體的表達文庫實驗（二）
方法λ噬菌體的平板培養1. 取適當大腸桿菌菌株的單克隆進行接種，按第 2 章方案 1 介紹的方法制備用于鋪平板的培養細菌。2. 假定每個 90 mm 平皿和 150 mm 平皿分別可長出 2X104 個和 5X104 個噬菌斑，計算篩選文庫所需平皿數。對應每個平皿準備一個無菌試管（13 mm
外源DNA片段在質粒載體中的克隆實驗原理和步驟
DNA重組技術包括載體及外源DNA片段的酶切消化、目的片段的獲得及純化、目的片段與克隆載體的體外連接、重組子的篩選和鑒定等內容。DNA片段的克隆技術是分子操作的核心部分。 實驗目的： 學習DNA的酶切、純化及外源片段與載體的連接，將BAC克隆所攜帶的外源DNA酶切片段亞克隆到pUC18載體上
可被單一限制酶切割用作克隆載體的λ噬菌體DNA的制備...
實驗方法原理 在某些情況下，制備好的 λ 噬菌體 DNA 經限制酶的簡單消化即可用于克隆。但只有當所用載體能用遺傳學方法篩選含有外源 DNA 序列的重組噬菌體時（如 EMBL 系列、λ2001、λDASH、λZAP、λgt10），這種方案才是可行的。因為在這種情況下，不必采取步驟來減少非重組
利用λ噬菌體文庫篩選－DNA－結合蛋白實驗
可利用合成雙鏈寡核苷酸篩選構建于λ噬菌體的 cDNA 表達文庫，以鑒定與特異 DNA 結合蛋白質相對應的克隆（Singhetal.1988,Vinsonetal.1988)。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）下冊，作者：〔美〕J. 薩姆布魯克 D.W. 拉塞爾。試劑、試劑盒ATP結合緩沖液變性溶
利用λ噬菌體文庫篩選－DNA－結合蛋白實驗
試劑、試劑盒 ATP結合緩沖液變性溶液二硫蘇糖醇EDTA乙醇激酶 連接酶緩沖液酚氯仿篩選緩沖液SDS醋酸鈉TET4 噬菌體 DNA 連接酶T4 噬菌體多核苷酸激酶合成的寡核苷酸[a-32P]ATP非變性聚丙烯酰胺凝膠儀器、耗材 烤盤結晶皿平頭鑷子裝有防水黑墨水注射器硝酸纖維素濾膜Sephadex G
利用λ噬菌體文庫篩選－DNA－結合蛋白實驗
? ? ? ? ? ? 試劑、試劑盒 ATP 結合緩沖液 變性溶液 二硫蘇糖醇 EDTA 乙醇激酶 連接酶緩沖液 酚 氯