核提取物的制備實驗
實驗材料 哺乳動物試劑、試劑盒 PBS低滲緩沖液低鹽緩沖液透析緩沖液儀器、耗材 轉子離心機電導計透析膜勻漿機離心管實驗步驟 1a. 收集轉瓶培養的細胞：將濃度為5~10×108細胞/l 的培養液用1 L 的塑料瓶1 850 g 離心20 min，將細胞收入50 ml 錐形離心管中（每管收2~3 L 培養液中的細胞）。進行步驟2。1b. 收集單層培養的細胞：單層細胞長滿后去掉培養液。用PBS洗1次。將細胞刮入新鮮PBS液里，倒進錐形離心管中。進行步驟2。2. 1 850 g 離心10 min。3a. 轉瓶培養細胞：測量壓緊后細胞的體積。將細胞重懸于約5倍于其pcv的PBS液中，1 850 g 離心10 min。進行步驟4。3b. 單層培養細胞：測量pcv，進行步驟4。4. 快速地將沉淀的細胞重懸于5倍體積的低滲緩沖液中，1 850......閱讀全文
核提取物的制備實驗
實驗材料?哺乳動物試劑、試劑盒?PBS低滲緩沖液低鹽緩沖液透析緩沖液儀器、耗材?轉子離心機電導計透析膜勻漿機離心管實驗步驟 1a.? 收集轉瓶培養的細胞：將濃度為5~10×108細胞/l 的培養液用1 L 的塑料瓶1 850 g 離心20 min，將細胞收入50 ml 錐形離心管中（每管收2~3 L
核提取物的制備實驗
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 通過向某些蛋白質溶液中加入某些無機鹽溶液后，可以降低蛋白質的溶解度，使蛋白質凝聚而從溶液中析出,這種作用叫作鹽析，是物理變化，可復原。對于特定的蛋白質，影響蛋白質鹽析的主要因素：無機鹽的種類、濃度、溫度和PH值。
核提取物的制備實驗（二）
從培養細胞中分離的細胞核制備成的提取物在體外轉錄和mRNA加工中具有精確的功能，（1）純化蛋白質（2）核提取物。 實驗材料 細胞核 試劑、試劑盒 KCl高鹽緩沖液 儀器、耗材 透析膜離心機 實驗步驟 1. ?按基本方案中歩驟1~7操作。 ?
核提取物的制備實驗（一）
從培養細胞中分離的細胞核制備成的提取物在體外轉錄和mRNA加工中具有精確的功能，（1）純化蛋白質（2）核提取物。實驗方法原理通過向某些蛋白質溶液中加入某些無機鹽溶液后，可以降低蛋白質的溶解度，使蛋白質凝聚而從溶液中析出,這種作用叫作鹽析，是物理變化，可復原。對于特定的蛋白質，影響蛋白質鹽析的主要因素
HeLa－細胞核提取物的制備實驗
試劑、試劑盒?甘油液氮MgCl2?6 H2O硫酸銨HeLa 細胞磷酸緩沖鹽溶液（PBS) 緩沖液 G緩沖液 H 緩沖液 DTM 緩沖液+0.1 ml L KCl實驗步驟 材料HeLa 細胞（培養和保存條件見下文。我們也成功地使用過 CellexBiosciences 公司制備并冷凍的 HeLa 細胞
HeLa－細胞核提取物的制備實驗
在本實驗中，基本上是按Dignam等（1983)所述的方法從HeLa細胞制備核提取物的。這一基本方法大概是制備體外轉錄和DNA結合實驗用因子的最常用的方法。本實驗來源于蛋白質純化與鑒定實驗指南，作者：朱厚礎。試劑、試劑盒甘油液氮MgCl2?6 H2O硫酸銨HeLa 細胞磷酸緩沖鹽溶液（PBS)緩沖液
哺乳動物細胞制備核和細胞質提取物—核提取物制備優化
實驗材料 轉瓶或單層培養的哺乳動物細胞（如HeLa細胞） 試劑、試劑盒 高鹽緩沖液分別含 0.8、1.0、1.2、1.4 及 1.6 mol L KCl 儀器、耗材 貝克曼 JS4. 2 轉子或相當的轉子50 mL 圓錐形刻度聚丙烯離心管（對較小體積的提取物也可用
從哺乳動物細胞中制備核和細胞質提取物—核提取物制備
實驗材料轉瓶或單層培養的哺乳動物細胞（如HeLa細胞）試劑、試劑盒PBS低滲緩沖液高鹽緩沖液含1. 2 mol L KCl透析緩沖液液氮儀器、耗材貝克曼 JS4. 2 轉子或相當的轉子50 mL 圓錐形刻度聚丙烯離心管（對較小體積的提取物也可用 15 mL 的離心管）Dounce 氏玻璃勻漿器（B
酵母提取物的制備實驗
實驗方法原理酵母細胞的裂解方法有很多種，包括自溶、壓力破碎（如French加壓罐）、研磨（玻璃珠振蕩）和酶裂解（如Zymolase)等。本方案討論的振蕩玻璃珠研磨，是最簡便的方法之一。這對于小體積（如＜1mL的）和數升體積都很有效。經相差顯微鏡檢測，細胞破碎率一般＞95%。實驗材料新鮮培養的酵母細胞
酵母提取物的制備實驗
基本方案 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 酵母細胞的裂解方法有很多種，包括自溶、壓力破碎（如French加壓罐）、研磨（玻璃珠振蕩）和酶裂解（如Zymolase)等。本方案討論
酵母提取物的制備實驗
實驗方法原理 酵母細胞的裂解方法有很多種，包括自溶、壓力破碎（如French加壓罐）、研磨（玻璃珠振蕩）和酶裂解（如Zymolase)等。本方案討論的振蕩玻璃珠研磨，是最簡便的方法之一。這對于小體積（如＜1mL的）和數升體積都很有效。經相差顯微鏡檢測，細胞破碎率一般＞95%。實驗材料 新鮮培養的酵母
制備體外剪接反應用HeLa細胞核和胞質S100提取物實驗
胞核提取物可以用于前體 mRNA 的剪接，S100 提取物中雖然包括許多剪接因子，但它不具有剪接活性，因為它只含有剪接所必需的部分 SR 蛋白，不過該提取物中補充一種或多種 SR 蛋白后就可以進行有效的剪接。本實驗來源「RNA 實驗指導手冊」主編：鄭曉飛。實驗方法原理胞核提取物可以用于前體 mRNA
制備體外剪接反應用HeLa細胞核和胞質S100提取物實驗
實驗方法原理 胞核提取物可以用于前體 mRNA 的剪接，S100 提取物中雖然包括許多剪接因子，但它不具有剪接活性，因為它只含有剪接所必需的部分 SR 蛋白，不過該提取物中補充一種或多種 SR 蛋白后就可以進行有效的剪接。實驗材料 HeLa 細胞試劑、試劑盒 DTT苯甲基磺酰氟PBS緩沖液儀器、耗材
制備體外剪接反應用HeLa細胞核和胞質S100提取物實驗
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 胞核提取物可以用于前體 mRNA 的剪接，S100 提取物中雖然包括許多剪接因子，但它不具有剪接活性，因為它只含有剪接所必需的部分 SR 蛋白，不過該提取物中補充一種或多種 SR 蛋白后就可以進行有效的剪接。
細胞和亞細胞提取物的制備實驗
從組織和細胞中提取蛋白可能是蛋白質組研究中最關鍵的一步，因為這一步影響了蛋白的產率、生物活性和特定目的蛋白結構的完整性。因此，我們要注意蛋白提取條件的選擇。主要目標是在破壞力最小、保持蛋白結構完整性的前提下，可重復地使細胞最大程度地裂解。方案1 哺乳動物組織的勻漿實驗實驗方法原理對于細胞內蛋白的純化
細胞和亞細胞提取物的制備實驗
方案1 哺乳動物組織的勻漿實驗 方案2 用于免疫沉淀的培養細胞的裂解實驗 方案3 用于免疫印跡的動物培養細胞、酵母和細菌的裂解實驗 方案4 氮艙減壓法裂解培養細胞實驗 方案5 細菌中重組蛋白的小量提取實驗 方案6 細菌中重組蛋白的
細胞和亞細胞提取物的制備實驗
實驗方法原理 對于細胞內蛋白的純化和特性分析，重要的是選擇一種有效的方法來破碎細胞或組織，使蛋白迅速地從胞內相對隔離的空間中釋放到緩沖液中，而該緩沖液應對所研究的蛋白的生物活性沒有影響。廣泛使用的破碎軟組織的方法之一是勻漿。在本方案中，討論了使用機械力勻漿組織：在 Potter-Elvehjem
哺乳動物精核的制備實驗
實驗材料 哺乳動物組織培養細胞（如 HeLa 細胞） 試劑、試劑盒 PBS裂解緩沖液緩沖液 B 儀器、耗材 帶有 B 型研磨棒的杜恩斯勻漿器光學顯微鏡 實驗步驟 1. 培養并收獲 3L 1×106?細胞/ml 的哺乳動物組織培養的細胞（如 HeLa），
哺乳動物精核的制備實驗
實驗方法原理 實驗材料 哺乳動物組織培養細胞（如 HeLa 細胞）試劑、試劑盒 PBS裂解緩沖液緩沖液 B儀器、耗材 帶有 B 型研磨棒的杜恩斯勻漿器光學顯微鏡實驗步驟 1. 培養并收獲 3L 1×106 細胞/ml 的哺乳動物組織培養的細胞（如 HeLa）， 用 1L PBS清洗兩次。2. 用 2
核纖層和富含核纖層組分的制備實驗
哺乳動物組織/組織培養細胞 爪蟾卵母細胞 果蠅胚 SPISULA 實驗材料 組織 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 試劑、試劑盒 溶液 H ? ? ? ? ? ? ?
核纖層和富含核纖層組分的制備實驗
哺乳動物組織/組織培養細胞 爪蟾卵母細胞 果蠅胚 SPISULA ? ? ? ? ? ? 實驗材料
核纖層和富含核纖層組分的制備實驗
實驗材料 組織試劑、試劑盒 溶液 H儀器、耗材 尼龍網勻漿器實驗步驟 組織制備1. 切碎組織，用加 250 mmol/L 蔗糖的 H 溶液清洗組織/組織培養物：溶液 H：15 mmol/L PIPES，pH 7.280 mmol/L KCl15 mmol/L NaCI0.5 mmol/L 精咪0.2
細胞和亞細胞提取物的制備實驗3
方案3 用于免疫印跡的動物培養細胞、酵母和細菌的裂解實驗實驗方法原理去垢劑裂解細胞法通常用于培養的動物細胞。典型的離子型去垢劑SDS(如2%SDS)能充分地裂解細胞。培養的動物細胞和細菌，如可以使用這種方式裂解。假如實驗所用的抗體識別的抗原決定簇取決于自然空間構象，并對還原環境敏感，那么在裂解緩沖液
細胞和亞細胞提取物的制備實驗8
方案8 酵母提取物的制備實驗實驗方法原理由于酵母的經典遺傳分析和分子遺傳分析都已經研究得非常透徹，因而對于純化重組動物蛋白來說，酵母是一個很有吸引力的表達體系。關于培養和收集酵母細胞的討論，尤其是芽殖酵母，參見 Jazwinski(1990)。酵母細胞的裂解方法有很多種，包括自溶、壓力破碎（如 Fr
細胞和亞細胞提取物的制備實驗6
方案6 細菌中重組蛋白的大量提取實驗實驗方法原理利用細菌獲得用于純化的重組蛋白是非常方便的。適用于細菌細胞蛋白提取的方法包括超聲波處理、玻璃珠研磨、釩土或石英砂研磨、French 加壓罐高壓剪切細胞和溶’菌酶處理。這些方法適用于從各種革蘭陰性菌和革蘭陽性菌中制備蛋白提取物。通常是使用酶的方法破壞細胞
細胞和亞細胞提取物的制備實驗5
方案5 細菌中重組蛋白的小量提取實驗實驗方法原理利用細菌獲得用于純化的重組蛋白是非常方便的。為了檢測誘導和重組蛋白的表達水平，評估方法的快速簡單是很重要的。本方案使用 0.5% TritonX-1OO 裂解細胞，小量制備細菌提取物。實驗材料表達目標重組蛋白的細菌細胞試劑、試劑盒二硫蘇糖醇（DTT)樣
細胞和亞細胞提取物的制備實驗4
方案4 氮艙減壓法裂解培養細胞實驗實驗方法原理通過來自增壓艙中的氮氣減壓膨脹來破碎細胞是一種快速、有效的細胞和組織的勻漿方法，能釋放完整的細胞器和制備細胞膜（Hunter and Commerford，1961)。該方法的原理很簡單：細胞放在一個壓力艙中，在高壓下（約5500kPa，相當于800ps
細胞和亞細胞提取物的制備實驗2
方案2 用于免疫沉淀的培養細胞的裂解實驗實驗方法原理培養的動物細胞一般使用溫和去垢劑來裂解。如果低濃度的去垢劑就能引起細胞的充分裂解（如 l%NP-40 或 l%Triton X-100)，那么這對目標蛋白的影響可能比方案 1 中所討論的勻漿方法更溫和。去垢劑的選擇必須根據免疫沉淀所用的抗體的識別表
細胞和亞細胞提取物的制備實驗7
方案7 從包含體中溶解大腸桿菌重組蛋白實驗實驗方法原理由于分子克隆技術能夠使細菌高水平表達蛋白，因此原核表達是一個非常便利的獲得重組蛋白的系統。遺憾的是這些蛋白在細菌中易于聚合和沉淀，形成難溶解的包含體，因而很難純化。非細菌蛋白的包含體尤其普遍。雖然沒有一種可用于所有蛋白的普適方法，還是有許多策略適
細胞和亞細胞提取物的制備實驗9
實驗方法原理差異去垢劑分離法（differential detergent fractionation, DDF) 包括使用一系列含不同去垢劑的 PIPES 緩沖液對細胞進行連續抽提，首先是毛地黃皂苷，其次是 Triton, 最后是 Tween/脫氧膽酸鹽。這些步驟產生 4 種在生化和電泳上相異的組