重組DNA的轉化實驗原理和操作步驟
實驗目的制備出感受態細胞，把體外重組的DNA引入受體細胞，使受體菌具有新遺傳性，并從中選擇出轉化子。實驗原理感受態就是細菌吸收轉化因子的生理狀態，只有發展為感受態的細胞才能穩定攝取外來的DNA分子。pUC18的LacZ基因區域當有DNA片段插入時，LacZ基因失活，轉化進入大腸桿菌并在含有IPTG和X-gal培養基生長時，會產生白色的克隆，不含插入片段的pUC18質粒進入宿主細胞生成藍色菌落。實驗操作（一）受體菌的培養與CaCl2 處理（無菌操作）1、取0.3ml種子液接到裝有30 ml LB液體培養基的三用瓶中，振蕩培養2-2.5小時2、取出一定量菌液置于冰浴10分鐘3、4，000rpm，4℃離心5分鐘，收集菌體4、把菌體懸浮在4 ml 100mM冷CaCl2 中，冰浴25分鐘。5、5，000rpm，4℃離心5分鐘，收集菌體6、再把菌體懸浮在1ml 100 mM冷CaCl2 中置4 ℃ 12-24小時，備用。（二）倒皿鋪平板1......閱讀全文
基因重組和DNA重組區別
基因重組是由于不同DNA鏈的斷裂和連接而產生DNA片段的交換和重新組合，形成新DNA分子的過程。 在人類的生殖細胞中發現的46條染色體發生在生物體內基因的交換或重新組合。基因重組是生物遺傳變異的一種機制，包括同源重組、位點特異重組、轉座作用和異常重組四大類。DNA重組指DNA分子內或分子間發生的遺傳
DNA重組技術
連接反應的策略?? 可以采用幾種策略來進行外源ＤＮＡ片段和質粒載體的連接。對此，可依據外源ＤＮＡ片段未的性質，以及質粒載體與外源ＤＮＡ上限制酸切位點的性質來作出選擇。（一）外源ＤＮＡ片段未的性質帶有各種未的外源ＤＮＡ的克隆方法見下表：────────────────────────────────
DNA轉化
DNA轉化Chemical Transformation·?????????Transformation of Competent Cells (RbCl2 Method)?(Goldberg Lab)Very nice protocol for E. Coli transformation inc
大腸桿菌感受態的制備及重組DNA的轉化
1．感受態的制備 （1）接種單菌落于2ml LB培養液中， 37℃過夜。 （2）取0.25ml過夜菌入25ml LB培養液中，37℃振搖4～6h至A590=0.4～0.6。 （3）倒入50ml管內，水浴10min，以2500～3000rpm離心5min，棄上清。 （4）緩慢加入75mmol/
關于DNA重組的重組修復介紹
有絲分裂和減數分裂期間由各種外源因子（例如紫外線，X射線，化學交聯劑）引起的DNA損傷都可以通過同源重組修復機制（HRR）來修復。 人類和嚙齒動物中減數分裂期間HRR所必需的基因產物的缺陷會導致不育 。人類HRR所必需的基因產物（例如BRCA1和BRCA2）的缺陷同時會增加患癌癥的風險。在細菌
重組DNA的分離、克隆與測序實驗手冊
?edited by??????????????? Bruce A. Roe??????????????? Judy S. Crabtreeand Akbar S. KhanDepartment of Chemistry and Biochemistry??????????????? The Uni
重組質粒（dna－recombinant－plasmid）的篩選實驗步驟
實驗儀器控溫搖床水浴鍋 冰箱（-20,‐70℃） 超凈工作臺 培養箱 實驗試劑 Amp LB IPTG X-Gal 平皿 玻棒 三角瓶 離心管 移液器 tip 實驗步驟： 20人／班 1平皿／人 挑取可疑的白色菌落，移植于2mL的LB中，250轉/分搖菌、37℃培養過夜。以快
質粒DNA高頻轉化大腸桿菌實驗
實驗材料?感受態細胞試劑、試劑盒?質粒DNA抗生素儀器、耗材?Ep管水浴鍋LB平板實驗步驟 1、取新制備的一管感受態細胞。?2、取0．03 ml感受態細胞轉和4 ng質粒DNA混勻，置冰浴30min?3、將 Ep管置于42 ℃水浴中熱沖擊2分鐘，立即置于冰上1分鐘。?4、在 Ep管中加70 ul L
DNA重組技術－連接
實驗概要? ? ? ? 體外連接獲得重組分子，用于轉化受體細胞。實驗原理? ? 質粒具有穩定可靠和操作簡便的優點。如果要克隆較小的DNA片段(＜10kb)且結構簡單，質粒要比其它任何載體都要好。在質粒載體上進行克隆，從原理上說是很簡單的，先用限制性內切酶切割質粒DNA和目的DNA片段， ?然后體外使
重組DNA的定義
中文名稱重組DNA英文名稱recombinant DNA;rDNA定 義經人工手段對其序列進行了改造和重新組合的DNA。應用學科生物化學與分子生物學（一級學科），方法與技術（二級學科）
重組－DNA－技術介紹
中文名稱重組 DNA 技術英文名稱recombinant DNA technique定 義在體外將兩個或多個不同的DNA片段全部或部分構建成一個DNA分子的方法。應用學科細胞生物學（一級學科），細胞生物學技術（二級學科）
DNA重組技術2
?感受態細胞的制備(一)制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態細胞 下述操作方案是由Hanahan(1983)提供的，所制備的大腸桿菌DHl、DH5和ＭＭ249感受態細胞培養物能使每微克超螺旋ＤＮＡ以≥5x108轉化菌落的頻率進行轉化，其他大多數大腸桿菌菌株的最高轉化率大約只有前述菌株的1/10-1/5。
DNA的重組連接
目的：了解T4DNA連接酶的幾種生物學功能及用途；學習在T4DNA連接酶的作用下，載體與目的基因的幾種不同的連接方式以及在標準的連接反應體系中，質粒載體和插入的外源DNA的比率關系和各自的用量；掌握用Pmd18-Tvector與PCR產物進行T-A克隆的機理及其應用。原理：外源DNA片段和線狀質粒載
重組－DNA－技術簡介
中文名稱重組 DNA 技術英文名稱recombinant DNA technique定 義在體外將兩個或多個不同的DNA片段全部或部分構建成一個DNA分子的方法。應用學科細胞生物學（一級學科），細胞生物學技術（二級學科）
DNA重組的定義
DNA復制是指DNA雙鏈在細胞分裂以前的分裂間期S期進行的復制過程，復制的結果是一條雙鏈變成兩條一樣的雙鏈，每條雙鏈都與原來的雙鏈一樣。這個過程通過邊解旋邊復制和半保留復制機制得以順利完成。
DNA重組（DNA－recombination）技術：工具酶
一、限制性內切酶限制性內切酶（restriction endonucleases，RE）是其中最重要的工具酶之一。它是一類核酸水解酶，能識別和切割雙鏈DNA分子中的特定核苷酸序列。（一）命名原則限制性內切酶大多從細菌中發現，根據來源進行命名，限制酶的第一個字母（大寫，斜體）為宿主菌的屬名，第二、第三
重組DNA的分離、克隆與測序實驗手冊2
C. Restriction digestionRestriction enzyme digestions are performed by incubating double-stranded DNA molecules with an appropriate amount of restrict
重組DNA的分離、克隆與測序實驗手冊3
G. Bacterial cell maintenanceFour strains of?E. coli?are used in these studies: JM101 for M13 infection and isolation (4), XL1BMRF' (Stratagene) f
重組DNA的分離、克隆與測序實驗手冊4
H. Fragment purification on Sephacryl S-500 spin columnsDNA fragments larger than a few hundred base pairs can be separated from smaller fragments by
重組DNA的分離、克隆與測序實驗手冊5
C. Random fragment end-repair, size selection, and phosphorylationSince both sonicated and nebulized DNA fragments usually contain single-stranded end
重組DNA的分離、克隆與測序實驗手冊6
Electroporation ProtocolPreparation of Electro-competent Cells:1. Grow XL1-Blue cells on a tetracycline plate (20 ug tet/ml of LB agar)2. Inoculate 3
重組DNA的分離、克隆與測序實驗手冊7
III. Methods for DNA isolationA. Large scale double-stranded DNA isolationThe method used for the isolation of large scale cosmid and plasmid DNA is a
重組DNA的分離、克隆與測序實驗手冊8
B. Midiprep double-stranded DNA isolationA midi-prep double-stranded DNA isolation has been developed to generate a sufficient amount of template DNA
重組質粒的電轉化法
首先，將0.1cm的電擊杯放在冰上進行預冷，凍存的感受態細胞取出冰上溶解。2然后，用100微升的感受態細胞加入1微升純化的連接液，或者加入0.5微升未純化的連接液，小心混勻，在冰上放置二十分鐘。3然后，將混合液加入預冷的電擊杯中，注意擦干杯外的水，防止電火花，放入電轉化儀的反應槽內，接上電源。4然后
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA序列測定3
2．利用末端轉移酶和α-32P-ddNTP標記DNA的3ˊ-末端 在二價陽離子存在下，末端轉移酶催化dNTP加入DNA分子的3ˊ-羥基末端，如果作為底物的核苷酸經過修飾（如ddNTP），則可以在DNA的3ˊ-OH上僅加入一個核苷酸。對于雙鏈DNA片段，亦存在DNA的兩側均被標記問題，可通過上述同
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA序列測定2
目前應用的兩種快速序列測定技術是Sanger等（1977）提出的酶法（雙脫氧鏈終止法）和Maxam（1977）提出的化學降解法。雖然其原理大相徑庭，但這兩種方法都同樣生成相互獨立的若干組帶放射性標記的寡核苷酸，每組核苷酸都有共同的起點，卻隨機終止于一種（或多種）特定的殘基，形成一系列以某一特定核苷酸
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA序列測定1
㈣ DNA聚合酶 如前所述，選用合適的DNA聚合酶進行測序反應也是保證測序質量的重要因素之一。常用于雙脫氧末端終止法測序的有幾種不同的酶： 1．大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段） 此酶是最早用于建立Sanger測序的酶。但通常會有兩個問題：①Klenow片段的持續合成能力較
質粒DNA導入細菌細胞實驗——電轉化法
實驗方法原理高壓電轉化簡單，快捷可靠，而且是目前效率最高的質粒DNA轉化大腸桿菌方法。不過該方法需要電轉化裝置。實驗材料菌落試劑、試劑盒LB甘油SOC儀器、耗材平板離心瓶聚丙烯管電阻器電轉化池實驗步驟1. ?接種一個單菌落于5 ml LB培養液，37°C溫和振搖培養5 h或過夜。2. ?將2.5 m
DNA重組技術－酶切
實驗概要? ? ? ? 通過酶切獲得可進行體外重組的載體和外源DNA實驗原理? ?DNA重組技術是用內切酶分別將載體和外源DNA切開，經分離純化后，用鏈接酶將其連接，構成新的DNA分子。? ? ?限制性內切酶能特異地結合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內或其附近的特異位點上，并切割雙鏈DN
DNA重組的作用機制
遺傳重組由許多不同的酶催化。重組酶是DNA重組過程中催化鏈轉移步驟的關鍵酶。?RecA是在大腸桿菌中發現的主要重組酶，負責修復DNA雙鏈斷裂（DSBs）。在酵母和其它真核生物中，修復DSB需要兩種重組酶。?RAD51蛋白是有絲分裂和減數分裂重組所必需的，而DNA修復蛋白DMC1對減數分裂重組具有特異