重組DNA的轉化實驗原理和操作步驟
實驗目的制備出感受態細胞，把體外重組的DNA引入受體細胞，使受體菌具有新遺傳性，并從中選擇出轉化子。實驗原理感受態就是細菌吸收轉化因子的生理狀態，只有發展為感受態的細胞才能穩定攝取外來的DNA分子。pUC18的LacZ基因區域當有DNA片段插入時，LacZ基因失活，轉化進入大腸桿菌并在含有IPTG和X-gal培養基生長時，會產生白色的克隆，不含插入片段的pUC18質粒進入宿主細胞生成藍色菌落。實驗操作（一）受體菌的培養與CaCl2 處理（無菌操作）1、取0.3ml種子液接到裝有30 ml LB液體培養基的三用瓶中，振蕩培養2-2.5小時2、取出一定量菌液置于冰浴10分鐘3、4，000rpm，4℃離心5分鐘，收集菌體4、把菌體懸浮在4 ml 100mM冷CaCl2 中，冰浴25分鐘。5、5，000rpm，4℃離心5分鐘，收集菌體6、再把菌體懸浮在1ml 100 mM冷CaCl2 中置4 ℃ 12-24小時，備用。（二）倒皿鋪平板1......閱讀全文
重組DNA轉化
目的：在體外連接組裝而成的重組DNA分子只能轉入合適的受體細胞，才能大量地進行復制、增殖和表達。通過實驗學會重組DNA轉化的最基本的操作以及如何提高轉化效率的基本思路。?原理：帶有外源DNA片段的重組體分子在體外構建成后，需要導入適當的宿主細胞內進行繁殖或表達出具有一定生物活性的蛋白。能夠作為重組體
重組DNA的轉化實驗原理和操作步驟
實驗目的制備出感受態細胞，把體外重組的DNA引入受體細胞，使受體菌具有新遺傳性，并從中選擇出轉化子。實驗原理感受態就是細菌吸收轉化因子的生理狀態，只有發展為感受態的細胞才能穩定攝取外來的DNA分子。pUC18的LacZ基因區域當有DNA片段插入時，LacZ基因失活，轉化進入大腸桿菌并在含有IPTG和
重組DNA分子的轉化實驗原理和實驗步驟（二）
1.1.4接合轉化接合（Conjugation）是指通過細菌細胞之間的直接接觸導致DNA從一個細胞轉移至另一個細胞的過程。這個過程是由結合型質粒完成的，它通常具有促進供體細胞與受體細胞有效接觸的接合功能以及誘導DNA分子傳遞的轉移功能，兩者均由接合型質粒上的有關基因編碼。在DNA重組中常用的絕大多數
重組DNA分子的轉化實驗原理和實驗步驟（一）
1實驗原理DNA重組分子在體外構建完成后，必須導入特定的受體細胞，使之無性繁殖并高效表達外源基因或直接改變其遺傳性狀，這個導入過程及操作統稱為重組DNA分子的轉化。對于不同的受體細胞，往往采取不同的轉化戰略。1.1 DNA重組分子的常用轉化方法1.1.1 Ca 2 誘導轉化1970年Mandel和H
重組DNA的轉化和藍白篩選
體外連接的重組DNA分子導入合適的受體細胞才能進行大量復制，增殖和表達，其首要目的是獲得大量的克隆基因。雖然PCR技術，體外轉錄及翻譯系統能部分達到大量擴增的目的，但畢竟受到體外操作的許多限制。重組質粒導入宿主細胞最常用的方法之一就是轉化（transformation）。轉化這一概念來源于遺傳學：細
DNA的轉化實驗
體外通過基因工程手段所構建的含目的基因的重組質粒，選用轉化和篩選技術， 可獲得含重組的陽性克隆。在此陽性克隆中，DNA可在生物體系中大量擴增，繁殖， 保存以及表達目的基因的產物，這是ＰＣＲ體外擴增DNA所不能替代的。配合DNA重組技術，所獲得的，不同目的需要的陽性菌株已廣泛應用于科研，醫藥生產和生物
DNA重組實驗方法
[實驗原理]DNA重組是將外源DNA與載體分子連接，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。DNA重組的方法主要有粘端連接法和平端連接法。 重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統中，將分別經酶切的載體分子與外源DNA分子進行連接。常用的DNA連接酶是T4噬
耐藥質粒－DNA轉化實驗
耐藥質粒 DNA轉化實驗 本實驗學習將質粒DNA分子轉入大腸桿菌的方法及如何篩選帶有質粒DNA的細胞克隆，即轉化子。 【原理】 受體菌Ecoli RRI 在低溫條件下經Ca++ 處理，可改變細胞膜的通透性，利于受體菌對DNA的攝取，這種經Ca++ 處理的細菌稱感受態菌。pBR322 質粒
DNA轉化實驗指導1
CONTENT?Transformation-Competent?E. coli?preparation???Inoue "ultra-competent" methodRubidium chloride methodCosmid packaging protocol?DNA Ligation an
DNA轉化實驗指導3
6.?????Simultaneous digestion of the pUC vector with both enzymes in the presence of 3 units of Shrimp Alkaline Phosphatase (Amersham BioSciences)?in
DNA轉化實驗指導4
2B.??Transformation?1.?????Preparation of electrocompetent DH5a?cells:??autoclave 4 baffled 1 liter flasks containing 500 mL LB.??Remove a 1 mL aliquo
DNA轉化實驗指導5
2C.??Notes on Transformation?1.?????Bacto tryptone and yeast extract can cause allergic reactions.?2.?????All containers used to handle the bacteria (
DNA轉化實驗指導2
1B.??Cloning?1.?????A caveat on dephosphorylation: the most common reason for failure to obtain colonies is a result of adding too much BAP or CIP to
質粒－DNA－的轉化實驗
實驗方法原理轉化活性是檢測質粒生物活性的重要指標，在基因克隆技術中，轉化（transformation）是特指以質粒 DNA 或以它為載體構建的重組質粒 DNA（包括人工染色體）導入細胞的過程， 是一種常用的基本實驗技術。 該過程的關鍵是受體細胞的遺傳學特性及其所處的生理狀態，用于轉化的受體細胞一般
質粒－DNA－的轉化實驗
實驗方法原理 轉化活性是檢測質粒生物活性的重要指標，在基因克隆技術中，轉化（transformation）是特指以質粒 DNA 或以它為載體構建的重組質粒 DNA（包括人工染色體）導入細胞的過程， 是一種常用的基本實驗技術。 該過程的關鍵是受體細胞的遺傳學特性及其所處的生理狀態，用于轉化的受
重組質粒（dna－recombinant－plasmid）的連接、轉化及篩選2
第二節 材料、設備及試劑一、 材料外源DNA 片段: 自行制備的帶限制性末端的DNA 溶液,濃度已知; 載體DNA : pBS質粒(Ampr ,lacZ),自行提取純化,濃度已知; 宿主菌: E. coli DH5α,或JM系列等具有α-互補能力的菌株。二、 設備恒溫搖床，臺式高速離心機，恒溫水浴鍋
重組質粒（dna－recombinant－plasmid）的連接、轉化及篩選1
第一節 概 述質粒具有穩定可靠和操作簡便的優點。如果要克隆 較小的DNA 片段(＜10kb)且結構簡單,質粒要比其它任何載體都要好。在質粒載體上進行克隆 ,從原理上說是很簡單的，先用限制性內切酶切割質粒DNA 和目的DNA 片段, 然后體外使兩者相連接, 再用所得到重組質粒轉化細菌,即可完成
DNA重組
目的：簡單介紹了DNA重組技術的一些方法。包括重組質粒、PCR等。包括細胞結構、DNA，DNA如何改點等。
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA重組的載體1
載體（vector）是攜帶靶DNA（目的DNA）片段進入宿主細胞進行擴增和表達的運載工具。常用的載體是通過改造天然的細菌質粒、噬菌體和病毒等構建而成。目前已構建成的載體主要有質粒載體、噬菌體載體、病毒載體和人工染色體等多種類型，亦可根據其用途不同分為克隆載體和表達載體二類。載體的構建和選擇應考慮以下
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA重組的載體2
二、噬菌體載體作為細菌寄生物的噬菌體，大多數具有編碼多種蛋白質的基因，能利用宿主細胞的蛋白質合成體系，進行生長和增殖。構建的噬菌體載體，以λ噬菌體、M13和粘粒最為常用。㈠ λ噬菌體載體野生型λDNA是一種基因組為4.8 kb的線性雙鏈DNA，全部序列已知，共編碼50多個基因。其中約一半基因參與
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA重組與鑒定1
重組DNA是在體外用限制性內切酶，將不同來源的DNA分子進行特異地切割，獲得的目的基因或DNA片段與載體重新連接，從而組成一個新的DNA雜合分子。重組的DNA分子能夠通過一定的方式進入相應的宿主細胞，在宿主細胞中進行無性增殖，獲得大量的目的基因或DNA片段，此過程稱基因克隆。重組的DNA分子也能夠在
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA重組的載體3
在作為載體時，這些噬菌體有一個很大的優點，即克隆到M13mp載體的外源DNA片段（雙鏈），在子代噬菌體便成為了單鏈形式。故應用M13mp進行克隆，可方便地分離到大量含有外源DNA某一單鏈的DNA分子。這種單鏈DNA可在下列工作中作模板：①主要用作雙脫氧鏈終止法進行DNA序列測定的模板；②制備僅有一條
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA重組與鑒定2
（1）CaCl2處理以后的轉化: 當細菌處于0℃、二價陽離子（如Ca2+、Mg2+等）低滲溶液中時，細菌細胞膨脹成球形，處于感受態；此時轉化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復合物粘附于細胞表面，重組DNA在42℃短時間熱沖擊后吸附在細胞表面，在豐富培養基中生長數小時后，球狀細胞恢復原
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA重組與鑒定3
當多克隆位點有外源DNA片段插入時，破壞此酶的N端閱讀框架，產生無α互補功能的N端片段，因此在帶有外源DNA片段的細菌在含有IPTG/X-gal的培養基上呈白色，見圖7-11 。如果外源DNA插入片段相當短，不破壞β-半乳糖苷酶的氨基端氨基酸序列的閱讀框，有時產生的重組體菌落不呈白色而是呈淺藍色。4
DNA重組實驗中常用的技術（二）
DNA的重組 （一）DNA的酶切與連接 （1）酶切反應 同質粒DNA的鑒定，只不過是質粒DNA換為載體DNA。若大量酶切，則成比例增加。 （2）加2倍體積的預冷無水乙醇和1/10體積的3mol/l NaAc混勻，-20℃2h以上。 （3）15000rpm離心15min，棄上清。 （4）加
DNA重組實驗中常用的技術(一）
一、質粒DNA的提取及鑒定（一）質粒DNA的提取及鑒定 1．收獲細菌 （1）將2ml含相應抗生素的LB液體培養基加入到通氣良好的15ml的試管中，接入一單菌落，于37℃劇烈振蕩培養過夜。 （2）將1.5ml培養物倒入1.5ml離心管中，用臺式離心機于4℃以12000g離心5min，將剩余的培養
DNA的重組連接實驗原理和步驟
一、實驗目的 用T4DNA連接酶將載體pBR322 EcoR Ⅰ-CIP處理的DNA片段，與目的基因5.4KbEcoR Ⅰ片段連接起來，構建體外重組DNA分子，同時學習幾種DNA連接的方法。 二、實驗原理 重組的DNA分子是在T4DNA連接酶的作用下，有Mg
DNA重組技術(Recombinant－DNA)實驗原理、用品和步驟（一）
【實驗原理】1．DNA重組技術重組DNA(Recombinant DNA)技術是遺傳工程的核心技術，也是人類在基因和DNA分子水平進行操作的技術。它包括以下幾個步驟： 1）重組DNA分子的構建：即將目的基因（DNA或cDNA片段）與載體DNA重組，應用TA克隆方法,將PCR擴增產物快速克隆至質粒
DNA重組技術(Recombinant－DNA)實驗原理、用品和步驟（二）
【實驗步驟】 1．PCR產物純化 PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，應用凝膠回收試劑盒回收純化目的DNA片段。 2．目的DNA片段連接至T/A克隆載體 即重組DNA分子的構建 反應體系及條件如下： 3．轉化 3.1 將感受態細胞置冰中融解。 3.2 將60μl感受態細胞移至無菌
DNA重組技術(DNA－Recombination)
一、DNA 的酶切與連接（1）酶切反應：同質粒DNA 的鑒定，只不過是質粒DNA 換為載體DNA 。若大量酶切，則成比例增加。（2）加2倍體積的預冷無水乙醇和1/10體積的3mol/l NaAc混勻，-20℃2h以上。（3）15000rpm離心15min，棄上清。（4）加入75%乙醇洗滌2次，離心棄