一種堅守：Bcl2抑制劑開發沉浮30年

　　對于細胞凋亡的研究可以追溯到150年前，但直到1984年，細胞凋亡途徑中的一種重要蛋白Bcl-2蛋白家族被發現，這個領域才迎來研發熱情的真正爆發。如今，每年有關細胞凋亡或程序性死亡的文章和相關出版物有20，000份，而Bcl-2蛋白家族是其中最重要和經久不衰的靶點之一。

　　Bcl-2蛋白家族在腫瘤的發生及轉移中起關鍵作用。依據結構、功能不同，Bcl-2家族蛋白可分為三類：抑制細胞凋亡蛋白，包括Bcl-2、Mcl-1和Bcl-xL等；促進細胞凋亡蛋白，包括Bak、Bax等；還有一類為僅含BH3結構域的促細胞凋亡蛋白，如Bad、Puma等。Bcl-2和Bak蛋白在細胞死亡信號檢查點之間的平衡，決定了細胞的生存或凋亡。由于在癌細胞中高度表達，Bcl-2蛋白抑制劑可以選擇性地發揮抗腫瘤作用。

　　發現32年以來，針對Bcl-2蛋白的研究眾多，重要性也毋庸置疑，但是針對該靶點的藥物開發卻始終困難重重。首個上市的藥物Venetoclax的開發即歷經20年，從化合物設計、篩選直到臨床試驗，不斷地“升級打怪”，不斷地克服障礙，不斷地推倒重來，其面對的困難是整個領域的共性難題，其經歷的波折幾乎代表了整個領域的沉浮。

　　Bcl-2蛋白調節細胞凋亡信號通路

　　FBDD方法學開路

　　最開始，這個領域的藥物開發集中在通過使用反義核苷酸抑制Bcl-2表達，但這是一次并不成功的嘗試。最具代表性的美國Genta公司1995年就開始進行這方面的研究，至少歷時10年的開發，將藥物genasense推到Ⅲ期臨床試驗，其上市申請在2004年被FDA拒絕，2007年提起的上訴也遭到駁回，兩度敲門FDA被拒。隨后有很多研究顯示這類化合物的活性來自其誘導干擾素的能力而不是抑制Bcl-2蛋白表達的能力。

　　對于關注這個領域的企業而言，從反義核苷酸入手，可能是一個不得已的選擇。因為Bcl-2靶點的成藥性一直是巨大的挑戰，想針對這個靶點設計小分子藥物非常困難，這一個共性的難題讓很多公司望而卻步。

　　關注這個領域20多年并親身參與到研發的亞盛醫藥共同創始人、董事長兼CEO楊大俊介紹，Bcl-2靶點成藥性難體現在3個方面。第一，從藥物化學角度來講，這個靶點的作用機理是蛋白—蛋白結合（PPI），相當于手掌對著手掌的互動，靶點結合的界面比較大，很難設計小分子去抑制它們之間的互動，發揮阻斷作用；第二，在PPI的諸多靶點中，Bcl-2結合的口袋相對比較大，大概有13~15個氨基酸，很難設計出小分子阻斷整個結合口袋；第三，從生物學來講，該靶點位于線粒體膜上，與成藥最多的細胞膜相比，線粒體膜有藥物輸送的問題。因為線粒體本身雙膜，藥物首先要能通過細胞膜，進入細胞漿里面，再作用于線粒體膜上面，進一步增加了成藥的難度。

　　解決這些問題，是關鍵的第一步。幾乎最早進入Bcl-2抑制劑開發領域的雅培（當時艾伯維還隸屬雅培），找到的解決方案是一個意義重大的方法學。當時，雅培的研發總監是Stephen W. Fesik，他本身就是一位結構生物學家。1997年，他和他的團隊共同在《科學》上發表了一篇文章《Discovering High-Af？nity Ligands for Proteins： SAR by NMR》，提出了一種藥物發現的新方法——以片段為基礎的藥物設計（FBDD），這開啟了一個全新的領域。

　　FBDD針對的就是Bcl-2結合口袋位點太大，小分子無法完全阻斷結合的問題。FBDD將結合口袋一分為二，變成兩個片段，然后用每個片段去篩選最佳小分子。再把得到的兩個小分子結合起來，試驗其結合靶點的活性。即使單個片段得到的小分子結合強度不夠，小分子聯合后，也可能增加上百倍甚至千倍的結合力。

　　曾經親身參與到Venetoclax的開發，負責蛋白結構研究的百濟神州的CFO兼首席戰略官梁恒博士，用更生動的方式解說FBDD的優勢：“如果蛋白上有兩個結合位點A和B，在A上有10個結合小分子的可能性，在B上有10個可能性，用普通的方式篩選，就是10×10，一百種可能性，需要做100個藥物來找到最佳分子。FBDD則是將兩個位點分開一個一個找最佳分子，理論上來說篩選20次就可以。當每個位點的可能性達到成百上千時，兩種篩選方式就是成千和成百萬的差距。所以，FBDD是一個更高效地找到最佳化合物的方式。”

　　事實上，FBDD的提出，不僅一定程度上解決了Bcl-2靶點的藥物發現，成為雅培最終成功將產品推上市的關鍵因素之一，還成為之后藥物設計經常使用的一個方法。目前，FBDD已經是藥物篩選的主流方式，有超過30個進入臨床研究的藥物來源于這種篩選方式，兩個藥物已批準上市。

　　化合物篩選“一波三折”

　　找到了適宜的工具，下一步就是利用工具找到合適的化合物分子。而這個過程幾乎成為整個Venetoclax開發中最漫長的階段。

　　Fesik帶領上百人的團隊專攻這個靶點，最先針對的是比較可及的Bcl-xL蛋白，歷經5年，才識別和發現一個可以結合到Bcl-xL表面活性口袋，并且能發揮出藥學特性的小分子——ABT-737。

　　ABT-737在臨床前的生物學活性非常好，但其一個重要成藥性缺陷是不能口服，必須注射給藥。考慮患者和腫瘤醫生更容易接受口服用藥，雅培沒有繼續研發ABT-737，轉而開始開發其他的化合物。

　　第二個被鑒定出有活性，并且可以口服的，是針對Bcl-2 和Bcl-xL雙靶點的抑制劑ABT-263。ABT-263在動物實驗中同樣體現出非常好的藥效，并于2006年被推上了臨床，做了大量的臨床試驗。但是該化合物很快被發現具有嚴重的血小板毒性。隨后的基礎研究發現，ABT-263抑制的兩個靶點之一Bcl-xL在成熟的外周血小板中表達，發揮藥理作用的同時也會降低外周血小板，這是一個跟靶點相關的毒性。當時的雅培采取了一個挽救措施，先用低劑量殺死一部分外周血小板，這樣制造血小板的細胞或者新生血小板對毒性的耐受性會比較好，但是這種方法并沒奏效，ABT-263受制于血小板的劑量限制性毒性，達不到治療窗口的效果，沒法進一步作為單藥開發。

　　這個嚴重的副作用導致的結果是，雅培的研發團隊不得不重新開始。ABT-263帶來的啟發，讓他們選擇開發具有選擇性的、只對Bcl-2有效的化合物。而從2007年6月，ABT-263進行臨床早期開發的階段，雅培就開始了與羅氏基因泰克的合作。口服有效，且僅針對Bcl-2蛋白的ABT-199，也就是后來上市的Venetoclax正是在這樣的合作中應運而生。

　　當然，這3個化合物也僅僅代表著雅培研發團隊篩選化合物中的九牛一毛。“每次遇到新的挑戰，我們的研究者就會利用新獲得的知識再重新開始，擊敗原先篩選出的化合物版本所具有的問題，不斷克服障礙。”艾伯維全球腫瘤部門負責人Rod Humerickhouse博士告訴《研發客》。

　　Bcl-2領域發展簡史 | 研發客整理作圖

　　令人“振奮”的臨床試驗暫停

　　ABT-199是否是一個令人滿意的化合物，能否最終成藥，還要依賴臨床研究結果。2011年，ABT-199開展了第一個臨床試驗，應用于慢性粒細胞性白血病（CLL）和非霍奇金淋巴瘤（NHL）。

　　就在ABT-199進展到臨床Ⅰ期的時候，遇到一個嚴重的小插曲，這個插曲直接導致臨床試驗一度被FDA叫停，不過，這卻被業內的人普遍視為一件好事。

　　被FDA暫停臨床試驗，是因為藥物在部分患者身上出現溶瘤細胞綜合征，這是一種可能導致患者死亡的嚴重疾病。為什么會被業內視為好事？因為這從側面證明了藥物的療效。溶瘤細胞綜合征發生的原因是藥物殺傷腫瘤細胞的效果太好太快，血液循環中的癌細胞一下子被殺死太多，造成很多腫瘤碎片，從而形成栓塞，堵住重要器官，引發了溶瘤細胞綜合癥。

　　臨床試驗被暫停后，雅培很快開始調整用藥的劑量，從低劑量開始，逐步增加劑量，讓血液中的腫瘤細胞慢慢減少，藥物批準之后也采用的是逐步增加劑量的服用方式。不到半年，ABT-199就恢復臨床試驗，此后的開發進展非常順利、非常迅速。

　　2014年，ABT-199開始進行針對CLL患者的Ⅲ期臨床試驗。隨后，不到一年時間即獲得FDA授予的3個“突破性療法認定”。第一個突破性認定在2015年4月授予單藥治療有17p缺失突變的CLL患者。2016年1月，被授予與利妥昔單抗聯用治療難治復發性CLL患者。同一月，突破性療法還被授予聯合去甲基化藥物（HMAs）一線治療不適合標準誘導治療（高劑量治療）的急性髓性白血病（AML）。

　　也是在2016年1月，FDA授予Venetoclax單藥治療既往已接受至少一種療法的CLL的新藥申請優先審查資格，3個月后，Venetoclax即獲批上市。

　　亞盛的另一條路徑

　　與艾伯維不同，作為另一家很早進入Bcl-2抑制劑研發領域的企業——亞盛醫藥走的是另一條路徑。

　　亞盛醫藥的兩位創始人楊大俊、王少萌原來均是美國密歇根大學的教授，王少萌主攻化學，楊大俊主攻藥理生物。2003年，兩位創始人通力合作，利用Bcl-2位點進行篩選，篩選出來一個天然產物的衍生物——AT-101。

　　彼時，在Bcl-2抑制劑領域，雅培的ABT-263還沒有進入臨床，只有加拿大一家公司開發的需注射的產品在臨床。在靶點還比較冷門的情況下，AT-101的3個特性（有天然產物安全性的數據可以借鑒，口服有效，同時抑制Bcl-2、Mcl-1、Bcl-xL這3個靶點）讓楊大俊具備充分的信心切入這個領域。

　　憑借這3個優勢，兩位創始人以AT-101為主打，快速進行了3輪融資，融資額達1億美元，在美國創立了亞生公司，開始進行AT-101的開發，很快就將產品推上了臨床。

　　不過，通過化合物庫篩選Bcl-2抑制劑藥物實際上也是一條坎坷的路徑。先來看看類似的其他產品的命運。最早由GeminX公司開發的obatoclax，2005年進入臨床研究，用于治療慢性淋巴細胞白血病、霍奇金淋巴瘤、骨髓纖維化和骨髓增生異常綜合癥。隨后，obatoclax被美國Cephalon公司收購。2011年，Cephalon公司被以色列藥企梯瓦以68億美元收購，obatoclax就此被梯瓦收入囊中。梯瓦隨即開展了obatoclax治療非小細胞肺癌的臨床試驗。但是到了2012年，公司未透露具體原因卻撤回了obatoclax的臨床招募，到了年底，梯瓦宣布完全終止該藥物的研發。而Coronado生物科技公司開發的apogossypol也沒有任何推動到臨床試驗中的進展。

　　再看AT-101的臨床歷程，其在推動到臨床Ⅱ期時也遭遇了最困難的階段。2009年，AT-101的Ⅱb臨床試驗結果揭盲，在十幾個臨床試驗中最重要的兩個，針對前列腺癌和非小細胞肺癌的臨床結果均沒有達到預期的目標。

　　楊大俊表示：“通常Ⅱb試驗是最重要的，效果好可以直接申請NDA，失敗就會影響未來開發，需要重新設計、重新開展臨床。正常情況下這也沒有問題，但AT-101臨床試驗揭盲時正趕上金融危機。最重要的臨床試驗沒有達到預期，加上金融危機，生物技術公司就很難在美國生存下去。”

　　臨床試驗結果與市場大環境均不利的情況下，亞生公司在美國IPO失敗。不過，這并不意味著他們放棄了AT-101。楊大俊聯合王少萌、郭明等創始人最終決定回國，在上海張江創立了新公司亞盛醫藥，并將多項原創藥物設計、開發與轉化技術帶回國內。

　　回國后，為了重振AT-101這個項目，亞盛醫藥采取了兩個重要措施。第一是在中國重新生產AT-101，將其作為1.1類新藥來申報。第二步，亞盛醫藥分析了AT-101在美國的14個臨床試驗、700例患者的研究結果，選擇了兩個臨床結果不錯，可能獲得批準的適應證——CLL和腦膠質瘤向CFDA申請了臨床批件。這兩個適應證分別在美國做了2~3個臨床試驗，已經有初步的療效苗頭。2014年10月，AT-101獲得CFDA批準開始進行Ⅱ期臨床試驗。此外，AT-101也在美國小范圍地進行兩個臨床試驗，一個是在梅奧醫院做CLL，一個是在密歇根大學做頭頸部的腫瘤。

　　現在，楊大俊已把更多精力放到了開發第二代、第三代的Bcl-2抑制劑上面。他表示，第一代產品的弱點是結合的強度不夠，所以從10年前就開始開發第二代產品APG-1252。APG-1252也是選擇性抑制Bcl-2和Bcl-xL蛋白的產品，但該產品在早期研發過程中成功解決了外周血小板的毒性問題，從而可以使APG-1252安全地用于實體瘤的治療，因為實體瘤大部分都會表達Bcl-xL，目前該產品已經向FDA、CFDA提交了臨床申請。第三代產品APG-2575也已經研發了六七年，這個產品選擇性抑制Bcl-2蛋白，主要針對血液腫瘤，而且從靶點蛋白選擇性上根本解決了血小板的毒性問題。

　　亞盛三代Bcl-2抑制劑作用機理

　　“鐵人三項”同場競技

　　若以體育競賽比喻Bcl-2抑制劑研發領域，楊大俊認為最合適的項目就是“鐵人三項”。攻克蛋白-蛋白結合等于跑馬拉松，克服其他的成藥性難題則是完成游泳和公路自行車，想要成功開發一個Bcl-2抑制劑，需要三項都達標，是對體力和耐力的雙重考驗，是相當難完成的任務。

　　正因為成藥性這一座大山，讓Bcl-2抑制劑開發注定門檻高高。雖然關注這個熱門靶點的企業并不少，想要開發相關藥物的也不在少數，但30年間，能推到臨床的產品卻少之又少。

　　2016年2月，《自然》雜志發表了一篇文章，總結Bcl-2靶點30年的發展歷程，文章中列出了4個具有代表性的進入臨床的產品，包括艾伯維的Venetoclax 、navitoclax（ABT-263），諾華的S-055746，加拿大生物醫藥公司ProNAi Therapeutics的PNT-2258。

　　即使進入臨床試驗，也可能九死一生，這4個產品的命運就截然不同。艾伯維的Venetoclax迅速推上市，navitoclax因為血小板毒性，重點放在聯合治療的試驗中。差不多10年前，諾華就曾購買一個處于臨床前的Bcl-2抑制劑，不過在開發兩年沒有進展后放棄了繼續開發，S-055746其實是諾華第二次進軍這個領域的產物。2014年，諾華從施維雅獲得當時已經進入Ⅰ期臨床試驗的產品，不過，除了2014年的合作報道，有關這個產品披露的信息極少，目前依然處于進展不明的狀態。而隸屬于RNAi療法，披露時處于Ⅱ期臨床試驗的PNT-2258，在今年8月，就因為臨床效果不佳被ProNAi宣布徹底放棄。

　　盡管這個領域的藥物開發目前的進展并不盡如人意，但Venetoclax上市還是給這個領域帶來了一些可喜的變化。

　　據楊大俊觀察，在Venetoclax顯示出良好的臨床試驗結果時，就有很多公司紛紛摩拳擦掌，準備進入這個領域。國外的企業可能3年前就已開始，國內的企業稍微晚一點，在藥物正式批準后，才想切入這個領域，而想要做Me-Too或者仿制藥也大有人在，只是目前都沒到可以披露的階段。Venetoclax的上市也給亞盛帶來積極的影響。楊大俊剛把AT-101引回國內時，面臨的最大困難就是投資人和藥審部門對這個產品靶點和成藥性的懷疑，Venetoclax的成功可以消除投資人和藥審部門的顧慮，增強投資人和藥審部門的信心。

　　當然，在楊大俊看來，Venetoclax上市最重要的意義是為腫瘤的治療和未來靶向聯合的治療提供了一個新的靶點、新的通路、新的機理，開辟了一個全新的腫瘤治療領域，為患者提供了新的選擇和新的手段。而作為單藥在B細胞腫瘤發揮重要的治療效果，開展跟免疫療法等聯合治療的研究將是這個領域未來的研發趨勢。

　　Venetoclax最先批準上市的適應證是17P缺失突變的CLL。美國國家癌癥研究所（NCI）數據顯示，CLL是成人中最常見的白血病類型，每年新確診15000例。而17p缺失突變與癌癥的惡化和耐藥性相關，攜帶該突變的患者被認為預后最差。Rod Humerickhouse介紹，在未經治療的CLL患者中，17p缺失突變的患者占3%~5%，在復發和難治性CLL中，占30%~50%，Venetoclax作為單藥治療，總緩解率（ORR）即可高達77%。

　　另外，Venetoclax還在進行針對急性髓細胞性白血病(AML)、多發性骨髓瘤（MM）、非霍奇金淋巴瘤（NHL）的臨床試驗。其中，針對AML已經報告出一些不錯的結果，其聯合HMAs治療AML已經獲得FDA突破性療法認定，今年8月，艾伯維在美國癌癥研究協會《Cancer Discovery》雜志發表的文章也顯示，在一個小型試驗中，觀察到19%的AML患者總體緩解，體現出潛在的治療價值。

　　實際上，B細胞腫瘤已經成為Bcl-2研發一大陣地。AT-101選擇的適應證包括CLL，S-055746針對的也是血液惡性腫瘤。從生物學角度來說，在B細胞腫瘤中，Bcl-2是一個驅動的、決定性的基因，B細胞腫瘤發生跟Bcl-2非常相關，所以抑制它就會產生很好的生物學和臨床效果。因此，Bcl-2抑制劑在這一領域未來的前景非常可觀。這種生物學上不可取代的意義也是很多企業堅持探索這個領域的重要原因。

　　在聯合用藥方面研究也不少。據不完全統計，Venetoclax在開展的聯合用藥試驗大約11個左右，針對的適應證包括AML、MM、NHL。Rod Humerickhouse表示。其中Venetoclax聯合利妥昔單抗治療CLL的MURANO試驗已經進行到Ⅲ期臨床試驗，預計2017年提交監管部門審評。亞盛醫藥的產品也開展了跟EGFR三代抑制劑AZD 9291的聯合研究。

　　結語

　　縱觀整個Bcl-2抑制劑研發領域的發展，會發現，新藥開發一開始是選擇題。追逐熱門的靶點，風險低但是可能面臨更激烈的競爭，堅定相對冷門的靶點，則面臨更多的風險，需要綜合衡量來做出決策。開發了三代Bcl-2抑制劑產品，同時專攻于開發細胞凋亡各靶點新藥的亞盛醫藥，最早成立美國亞生時也同時開發其他的靶點，最終選擇專注于細胞凋亡產品開發，是考慮避開競爭激烈的領域，堅信在相對冷門的領域堅持下來，就可以成為這個領域的leader。

　　選擇之后則是持之以恒的過程。無論艾伯維或是亞盛醫藥，談到Bcl-2抑制劑的開發，堅持都是被反復提及的關鍵詞。第一個化合物篩選耗費5年對于跨國大藥企來說其實并不多見。不斷遇到挑戰，卻能不斷重新開始被視為成功的關鍵。

　　而這些也正是楊大俊最想傳達給業界的：“做研發一定要堅持做原創，不能說哪個熱門就做哪個。這對中國的臨床研究領域、企業的新藥開發、整個社會需求來講都非常重要。哪怕是冷門，監管部門、投資人也必須支持這種創新和原創。否則，我們只能跟在別人后面，沒法做到領先。只有原創和領先才有可能為患者提供更具差異化的臨床治療價值，為公司和投資人帶來更高的財務回報，為中國在全球新藥開發的戰場開辟一席之地。”