基因編輯技術是什么

基因編輯技術不斷發展，到現在已發展到第三代基因編輯技術。第三代基因技術CRISPR/Cas克服了傳統基因操作的周期長、效率低、應用窄等缺點。作為一種最新涌現的基因組編輯工具，CRISPR/Cas能夠完成RNA導向的DNA識別以及編輯。通過一段序列特異性向導RNA分子（sequence- specific guide RNA）引導核酸內切酶到靶序列處，從而完成基因組的精確編輯，因其操作簡單、成本低、高效率，近幾年成為炙手可熱的基因編輯手段，目前已廣泛用于模式生物研究，醫療，植物作物，農業畜牧等領域。

1 磨快CRISPR利器，加快科學發現

CRISPR/Cas9的出現給了科研人員無限想象的可能，基于CRISPR/Cas9的技術很快就被廣泛應用于全世界各個實驗室中，這里我們將主要介紹最常用的幾種應用。

早期，科研人員通過同源重組（HR）介導的基因打靶技術來實現基因編輯，但因效率太低，極大地限制了其應用。為了克服這一難題，一系列通過核酸內切酶介導的基因編輯技術被開發出來，通過這些核酸內切酶切割特定的基因組序列，借助細胞自身修復體系如非同源末端連接或同源重組修復方式，并由此達到改變基因組序列的目的，鋅指核酸內切酶（ZFNs）、類轉錄激活因子效應物核酸酶（TALENs）以及sgRNA介導的Cas9核酸內切酶正是基于此原理工作的。

鋅指核酸內切酶（ZFNs）和類轉錄激活因子效應物核酸酶（TALENs）均可通過蛋白-DNA相互作用識別基因組上的特定DNA序列并完成特定位點的切割，但是它們因效率低下、可選潛在位點少、成本高等原因極大地限制了它們的應用，直到CRISPR/Cas9系統的出現，科研人員才找到了一種成本低、效率高、簡單易用的基因編輯工具。

CRISPR/Cas9出現之后，科研人員最先想到的便是將其運用到基因編輯上了，根據目標基因的外顯子序列設計single guide RNA（sgRNA）并與含有Cas9編碼序列的質粒一起轉入細胞，sgRNA通過堿基互補配對的原則引導Cas9蛋白靶向目標DNA序列，Cas9蛋白會在該位點切割DNA，引發DNA雙鏈斷裂（DSB），此時細胞通過非同源末端連接修復（NHEJ）完成DNA的自身修復，

因修復過程中常常發生堿基的添加和丟失，而最終導致基因的移碼突變從而達到基因敲除的目的，或者針對目的基因的上下游序列各設計一個sgRNA，從而引發該基因上下游同時發生DSB，再通過DNA損傷修復機制將斷裂的上下游兩端的DNA連接在一起，引發DNA片段缺失，從而達到基因敲除的目的。如果在此基礎上為細胞引入一個修復的模板質粒，細胞就會以此模板進行同源重組修復，如果引入的修復模板是一個想要插入的基因，便可在特定的位置進行基因敲入了。

2 神奇的dCas9多功能工具包

隨著人們對Cas9研究的不斷深入，Cas9發揮功能的結構基礎也漸漸明確，在Cas9發揮切割DNA的功能時，它的兩個結構域發揮著重要作用，分別是RuvC和HNH，其中HNH結構負責sgRNA互補鏈的切割，切割的位點位于PAM的5'端的第三個堿基外側，RuvC結構域負責非互補鏈的切割，切割位點是在PAM上游的3-8堿基之間，當將這二者同時突變失活，便產生了失去DNA切割活性的Cas9蛋白了（dCas9），dCas9雖然失去了對DNA的切割能力，但依舊可以在sgRNA的引導下到達指定的DNA序列處，這是基于sgRNA–dCas9復合體的這一特征，若在dCas9上融合不同功能的結構域，便可在特定的DNA區域完成不同的修飾了，這便形成了基于CRISPR/dCas9的工具包了。

腦洞大開的科學家利用dCas9蛋白，開發出各種用途的工具，可謂是把CRISPR/dCas9利用得淋漓盡致，這里我們舉幾個簡單的例子如研究人員針對目標基因的啟動子序列設計sgRNA，使得sgRNA–dCas9復合體靶向結合到目標基因的啟動子上，因dCas9蛋白帶來的空間位阻可干擾轉錄因子的結合，從而引發在轉錄水平上的干擾基因表達的效果，而在此基礎上為了達到更佳的干擾效果，一些能夠引發基因轉錄阻遏的結構域也被融合到dCas9蛋白上，如KRAB（Krüppel-associated box）等。

既然可以通過CRISPR/dCas9實現基因表達的干擾，那是不是也可以通過CRISPR/dCas9實現激活基因表達呢？答案是肯定的。科研人員通過向dCas9上融合vp64（四個串聯的vp16）、p65AD（p65 activation domain）等促進促進基因轉錄的結構域，實現基因的內源性激活，在經過各種優化之后，比如由vp64、p65AD和VPR（Epstein-Barr病毒R反式激活因子Rta47）組成的三聯結構域（dCas9–VPR）就可以實現很高水平的內源性激活基因表達的效果了。

通過基于CRISPR/dCas9的基因表達干擾和內源性激活工具的建立，使得科研人員在進行諸如基因功能研究的工作時有了更為簡單、高效且低成本的研究工具。這很大程度上為科研人員節約了時間和成本。

3 精準編輯表觀遺傳修飾

表觀遺傳研究是近些年來非常火熱的領域，DNA甲基化、組蛋白乙酰化等都在生物體中發揮著重要的生物學功能，而CRISPR/dCas9在表觀遺傳的研究中也成為了十分強大的工具。比如CRISPR/dCas9介導的靶向DNA甲基化修飾，我們知道在DNA甲基化過程中DNA甲基轉移酶（DNA methytransferases，DNMTs）起著關鍵的催化作用，而且大部分DNA甲基化都發生在CpG島，

因此研究人員嘗試著將DNMTs的催化結構域融合到dCas9上形成dCas9-Dnmt3a3L，并通過sgRNA的引導靶向目標DNA序列的CpG附近催化其甲基化，以實現DNA甲基化的定點編輯。相似地，研究人員將在DNA去甲基化過程中起關鍵催化作用的TET1蛋白的催化結構域融合到dCas9上形成dCas9-TET1，同樣的通過sgRNA的引導靶向目標DNA序列的CpG附近，可以實現去甲基化修飾。

再如CRISPR/dCas9介導的靶向組蛋白修飾，與靶向DNA甲基化修飾相似，一些和組蛋白修飾相關的酶包括組蛋白去甲基化酶（LSD1/KDM1A）、組蛋白乙酰轉移酶以及組蛋白甲基轉移酶等也被融合到dCas9蛋白上，以實現靶向組蛋白修飾。

除以上的應用外，CRISPR/dCas9還被用于其他多個領域，比如將EGFP融合到dCas9上，通過sgRNA靶向特定DNA序列實現基因組成像。此外，還有研究人員開發出基于CRISPR/dCas9的enChIP技術，以來探測特定基因組區域上的DNA-蛋白質相互作用，通過sgRNA靶向特定基因組基因座的標記dCas9的抗體免疫沉淀，之后通過蛋白質譜（enChIP-MS），鑒定與之特異性相互作用的蛋白質。這些工具的開發都極大地幫助了科研人員，使得之前無法實現的操作成為可能，推動了生命科學的快速發展。

4 基因及藥物靶標基因的確定

以往基于ZFN或TALENs的基因組編輯技術，需要針對DNA靶序列設計蛋白質，而CRISPR技術僅需要根據不同的靶序列合成相應的80nt左右的sgRNA來引導Cas9蛋白對序列進行修飾，這就實現了基因編輯技術的高通量應用。

CRISPR全基因組篩選技術可用于必需基因及藥物靶標基因鑒定。多倫多大學Jason Moffa研究組建立了覆蓋全基因組gRNA庫并在5個細胞系中逐個敲除了1.8萬個基因，最后鑒定出在不同細胞系間保守的1580個必需基因構成的“core fitness genes”。

同樣，美國達納-法伯癌癥研究所W. Nick Haining研究組通過CRISPR/Cas9系統性地敲除了黑色素瘤細胞的2368個基因，發現ptpn2基因缺失會使這些癌細胞對PD-1阻斷更加敏感。華盛頓大學醫學院Michael Diamond研究組利用CRISPR/Cas9鑒定在宿主細胞中堅定了黃病毒感染所絕對必需的9個基因，其中spcs1基因缺失時，不僅降低黃病毒感染率，而且對細胞也不產生副作用，這將是一個潛在的黃病毒藥物靶標。

5 疾病建模及器官供體產生

CRISPR/Cas9作為新一代基因編輯技術，同樣可被應用于建立疾病模型及培育供體器官。基因治療可實現在患者自身細胞中糾正遺傳缺陷，并結合其他生物學技術在體外培育出組織特異性的“類器官”，對于疾病建模、藥物篩查及臨床治療等方面研究有極大意義。CRISPR介導的基因組編輯技術可以直接應用于非人類哺乳動物的疾病模型建立，將更有利于疾病致病機理和治愈研究。

此外，CRISPR技術還可應用于大型動物的基因編輯以研究免疫排斥及跨物種的疾病傳染，從而解決異種移植器官來源的瓶頸，豬被認為是人體異種器官來源的首選動物，而目前豬器官用于人類的主要障礙為免疫排斥反應，及豬內源性逆轉錄病毒（Porcine endogenous retroviruses, PERVs）帶來的醫療風險問題。eGenesis公司楊璐菡博士與哈佛大學George Church教授利用CRISPR進行基因改造一步讓62個PERV pol 基因關閉，因而將來自PERV的傳染風險降低了三個數量級，成功培育出不含PERVs的豬品系，作為安全有效的異種移植器官來源，這些研究讓豬成為病人的器官來源更有前景。