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實驗材料 大腸桿菌試劑、試劑盒 LBTEM13聚乙二醇容易讓頂層瓊脂乙酸鈉乙醇儀器、耗材 巴斯德吸管試管離心機實驗步驟 1. 如果起始用M13復制型DNA或M13單鏈DNA，以0.5 ng 重組M13mp復制型DNA或5~10 ng 單鏈DNA轉化40 μl 感受態大腸桿菌DH5αF'株，按熱休克方案進行轉化。2. 轉化細胞加0.2 ml大腸桿菌DH5αF'過夜培養物后，混勻于3 ml H頂層瓊脂，傾倒于37℃平板，倒扣后置于37℃過夜。3. 大腸桿菌DH5αF'過夜培養物以2×TY培養液稀釋100倍，分裝于18 mm×150 mm 試管，每份1.5 ml。 4. 用無菌巴斯吸管挑取M13mp 噬斑，并置于上述每份培養物中，要注意確保瓊脂塊已玻轉移。5. 重復進行挑斑，在37℃生長細菌5~6 h。6. ......閱讀全文
分子雜交技術 互補的核苷酸序列通過Walson-Crick 堿基配對形成穩定的雜合雙鏈分子DNA 分子的過程稱為雜交。雜交過程是高度特異性的,可以根據所使用的探針已知序列進行特異性的靶序列檢測。雜交的雙方是所使用探針和要檢測的核酸。該檢測對象可以是克隆化的基因組DNA,也可以是細胞總DN
PCR技術代替了為測序而反復進行的分子克隆和模板制備步驟。PCR技術與自動測 序技術相結合后，它將成為一種最快、最有效的測定核苷權序列的方法。本章主要綜 述各種測模板的制備以及如何完成PCR產物的直接測序。與傳統的將PCR片段克隆入質 粒或病毒基因組相比，直接序列分析有兩個主要的優點:1)由于它是一
目前應用的兩種快速序列測定技術是Sanger等（1977）提出的酶法及Maxam和Gilbert(1977)提出的化學降解法。雖然其原理大相徑庭，但這兩種方法都是同樣生成互相獨立的若干組帶放射性標記的寡核苷酸，每組寡核苷酸都有固定的起點，但卻隨機終止于特定的一種或者多種殘基上。由于DNA上的每一個堿
人類基因組計劃的核心內容之一是基因組測序。隨著人類基因組圖譜趨于完成，人類基因的 定位克隆、鑒定分析直至全基因組測序取得了突破性進展，測序策略的成熟、測序方法的改進、自動測序儀的廣泛應用、計算機數據分析系統的擴展以及測序分析能力的提高， 大大推進了大規模DNA測序的進程。第一節 DNA測序的基本方法
下面的方案描述了鳥槍法測序的起始步驟，從靶 DNA 的剪切到用 M13 噬菌體載體構建 DNA 片段文庫，也包括斷裂靶 DNA 的兩種方法--超聲法和噴霧法，以及用 DNA 聚合酶修復片段末端的技術要點。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）下冊，作者：〔美〕J. 薩姆布魯克 D.W.拉塞爾。試劑、
試劑、試劑盒 乙酸銨 ATP 乙醇 甘油 蒸餾水 IPTG Mg
(2)測序引物同位素標記測序引物:用[yP]ATP或[γP]ATP和T4多聚核苷酸激酶對引物的5末端進行同位素標記。引物濃度:0.1~0.2mmol/L非同位素標記測序引物:用熒光標記4種雙脫氧核苷酸,可以進行以熒光為基礎的雙脫氧測序反應。 (3)DNA聚合酶應為無3→5外切活性的耐熱DNA聚合酶。
三、新一代DNA測序技術DNA測序技術已廣泛應用于生物學研究的各個領域，很多生物學問題都可以借助高通量DNA測序技術予以解決。過去三年，大規模平行 測序平臺（massively parallel DNA sequencing platform）已經發展為主流的測序技術，這項測序技術的出現不僅
目前市場上有四種高通量測序儀，分別是Solexa，454 (GS-FLX)，SOLiD和Polonator。根據測序原理，它們可以被分為兩大類：使用合成法測序(Sequencing by Synthesis)的Solexa和454，及使用連接法測序(Sequencing by Ligat
2018年9月8日，在華大基因集團19周年慶前夕，華大智造首次向業內公開華大智造測序儀文庫構建核心序列，致敬華大基因集團。華大智造成立于2016年，一直致力于研發和生產基因測序設備。如行業內小伙伴們所知，華大智造已擁有四款高通量測序儀——BGISEQ-500、BGISEQ-50、MGISEQ-2
自從 Sanger等(1975)引人雙脫氧核苷三磷酸( ddNTP)作為鏈終止劑,DNA序列測定技術得到迅速發展。 ddNTP在DNA聚合酶作用下,通過其5三磷酸基團可以摻入到正在延伸的DNA鏈中,但由于其脫氧核糖3位置缺少一個羥基,因此不能同后續的dNTP形成磷酸二酯鍵,使得DNA鏈的延伸
1.1.3.2 模板制備程序完全的體外大規模模板制備工作是達成高通量、低價格測序技術的前提。已廣泛使用的乳液PCR擴增技術就是一種很好的方法。不過，由于很難在熱循環測序反應中保證乳液微滴的穩定性，因此最開始實驗的模板擴增方法是恒溫擴增法（isothermal）。乳液PCR不需要借助細菌的幫助就能擴增
DNA測序基本原理及流程1977年，Sanger等人發展建立起來的一種DNA測序方法。基本原理：雙脫氧鏈末端終止法雙脫氧鏈末端終止法通過使用鏈終止劑—類似于正常dNTP的2’,3’-雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)，將延伸的DNA鏈特異性地終止。其反應體系也包括單鏈模板、引物、4種dNTP和DNA聚合
實驗概要 在分子生物學研究中，DNA的序列分析是進一步研究和改造目的基因的基礎。目前用于測序的技術主要有Sanger等（1977）發明的雙脫氧鏈末端終止法和Maxam和 Gilbert（1977）發明的化學降解法。這二種方法在原理上差異很大，但都是根據核苷酸在某一固定的點開始
第一代測序技術-Sanger鏈終止法 一代測序技術是20世紀70年代中期由Fred Sanger及其同事首先發明。其基本原理是，聚丙烯酰胺凝膠電泳能夠把長度只差一個核苷酸的單鏈DNA分子區分開來。一代測序實驗的起始材料是均一的單鏈DNA分子。第一步是短寡聚核苷酸在每個分子的相同位置上退火，然后
實驗方法原理Promega公司的SILVER SEQUENCETM DNA測序系統是一種無放射性的序列分析系統，它通過靈敏的銀染方法檢測凝膠中的條帶。 銀染提供了一種對于放射性或熒光法來說更加快速，廉價的替代方法。測序結果可以在同一天內得到；電泳完成后經90分鐘就可讀序，這是常規的放射性測序法做不到
本方案參照了 Tabor 和 Richardson(1987a,1989b,1990) 的方法，采用單鏈 DNA 模板進行 DNA 測序（有關單鏈 M13 噬菌體和質粒 DNA 制備，請參見第 3 章的方案 4、8 和第 12 章的方案 1)。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）下冊，作者：〔美〕
第一節 概述 聚合酶鏈反應或多聚酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction, PCR），又稱無細胞克隆技術(“free bacteria”cloning technique)，是一種對特定的DNA片段在體外進行快速擴增的新方法。該方法一改傳統分子克隆技術的模式，不通過活細胞，操作
一、概述T7 DNA聚合酶最初具有5'→3'聚合酶活性以及單鏈和雙鏈3'→5'外切酶活性。當T7 DNA聚合酶用適當方法處理后，可使3'→5'外切酶活力明顯下降。改造后的T7 DNA聚合酶又稱T7測序酶。使用T7測序酶得到的測序數據具有在每個堿
用大腸桿菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段及單鏈 DNA 模板進行雙脫氧測序實驗試劑、試劑盒 dATP去離子蒸餾水EDTA延伸 終止混合液和示蹤混合液甲酰胺上樣緩沖液Tris-Cl酶和緩沖液大腸桿菌 DNA 聚合酶ⅠKienow 片段核酸和寡聚核苷酸寡核苷酸引物單鏈 DNA 模板放射性化合物
試劑、試劑盒 去離子蒸餾水二硫蘇糖醇dNTP 和 ddNTP標記混合液和 ddNTP 延伸 終止混合液甲酰胺上樣緩沖液測序酶稀釋緩沖液測序酶反應緩沖液含MgCl2測序酶酵母無機焦磷酸酶寡核苷酸引物模板 DNA放射性化合物儀器、耗材 離心機和轉頭微量離心管或微量滴定板實驗步驟&nb
試劑、試劑盒 去離子蒸餾水 二硫蘇糖醇 dNTP 和 ddNTP 標記混合液和 ddNTP 延伸 終止混合液
進化遺傳學具有兩個并列的研究方向：系統發育的重建和種群分析。自1962年， Zuckerkandl和Pauling提出蛋白質序列和基因序列的比較可以象分子種一樣用于標志 現存物種分化的時間以來，各種生化方法被用于系統發育的研究。在最初二十年內， 同功酶的電泳分析、免疫學比較和蛋白質序列分析被廣泛地應
一、RNA 制備 模板mRNA 的質量直接影響到cDNA 合成的效率。由于mRNA 分子的結構特點,容易受RNA 酶的攻擊反應而降解,加上RNA 酶極為穩定且廣泛存在,因而在提取過程中要嚴格防止RNA 酶的污染,并設法抑制其活性,這是本實驗成敗的關鍵。所有的組織中均存在RNA 酶,人
試劑、試劑盒 乙酸銨 氯仿 異戊醇 DMSO 乙醇 NaOH酚
1.1.1 摩爾定律對454測序儀的影響454測序儀的迅猛發展不是因為我們想要Sanger測序儀小型化，而是因為新型奔騰芯片的出現以及摩爾定律法則給我們帶來的希望。很明顯，常規的人類基因測序項目會對我們處理測序技術的能力提出更高要求，這與我們對計算機處理能力的要求是一樣的。不過，只有將計算機的電子管
試劑、試劑盒 dATP 去離子蒸餾水 EDTA 延伸 終止混合液 和示蹤混合液 甲
雙脫氧鏈終止法變性模板 分子克隆實驗指南（第三版）下冊 第12章 方案2下面通過堿變性質粒 DNA 的方法應與方案 3 聯合使用，因在此過程中采用測序酶催化雙脫氧測序反應。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）下冊，作者：〔美〕J. 薩姆布魯克 D.W. 拉塞爾。試劑、試劑盒乙酸銨氯仿異戊醇DMSO
第1代測序技術——熒光標記的Sanger法 在第一臺全自動測序儀出現之前，使用最為廣泛的測序方法就是 Sanger 在 20 世紀 70 年代中期發明的末端終止法測序技術。 Sanger 也因此獲得 1980年的諾貝爾化學獎。 他的發明第一次為科研人員開啟了深入研究生命遺傳密碼的大門。G1.1&nb
試劑、試劑盒 乙酸銨氯仿異戊醇DMSO乙醇NaOH酚測序反應緩沖液瓊脂糖凝膠寡核苷酸引物閉環雙鏈質粒 DNA儀器、耗材 干冰-乙醇浴65°C 水浴實驗步驟 材料緩沖液和溶液試劑、緩沖液、儲液的組成參見附錄 1, 儲液使用前稀釋到適當濃度。乙酸銨（5mol/L, 非緩沖，pH~7.4)氯仿：異戊醇（2