在質粒載體中進行平末端片段的克隆
在質粒載體中進行平末端片段的克隆1．分別設立兩個反應，用適當的限制性內切核酸酶消化1~10μg質粒DNA和外源DNA片段，使它們能產生平末端。2．苯酚：氯仿抽提與乙醇沉淀法純化出已被消化的載體和外源DNA片段。3．分別用TE（pH 8.0）重新溶解純化出的兩種DNA沉淀，使終濃度為100 ng/ml。 假設1 bp相當于660 Da，計算DNA的終濃度（pmol/ml）。4．將載體DNA去磷酸化。5．按下表將適量的DNA轉移至無菌的0.5 ml離心管： 管號DNAA和E載體1 [60fmol (~100ng)]B外源插入片段2[60fmol (~10ng)]C和F載體1（60fmol）和外源插入片段3（60fmol）D線狀載體（5’-磷酸化）（60fmol）G環狀載體[60fmol (~10ng)]1 載體DNA已進行去磷酸化2 外源目的DNA可以連接接頭......閱讀全文
在質粒載體中進行平末端片段的克隆
在質粒載體中進行平末端片段的克隆1．分別設立兩個反應，用適當的限制性內切核酸酶消化1~10μg質粒DNA和外源DNA片段，使它們能產生平末端。2．苯酚：氯仿抽提與乙醇沉淀法純化出已被消化的載體和外源DNA片段。3．分別用TE（pH 8.0）重新溶解純化出的兩種DNA沉淀，使終濃度為100 ng/ml
在質粒載體中進行平末端片段的克隆
1．分別設立兩個反應，用適當的限制性內切核酸酶消化1~10μg質粒DNA和外源DNA片段，使它們能產生平末端。2．苯酚：氯仿抽提與乙醇沉淀法純化出已被消化的載體和外源DNA片段。3．分別用TE（pH 8.0）重新溶解純化出的兩種DNA沉淀，使終濃度為100 ng/ml。?假設1 bp相當于660 D
在質粒載體中進行平末端片段的克隆實驗
克隆平末端的目的片段時，為最大量地獲得“正確”的連接產物，載體和目的 DNA 在連接反應中的比例必須適當。每一重組體中外源 DNA 的連接方向和插入數量都必須用限制酶酶切圖譜分析或其他方法加以鑒定。作為一般規律，如果連接反應中質粒和目的 DNA 摩爾數相等，而且 DNA 的總濃度少于 100 μg/
在質粒載體中進行平末端片段的克隆實驗
實驗方法原理 克隆平末端的目的片段時，為最大量地獲得“正確”的連接產物，載體和目的 DNA 在連接反應中的比例必須適當。每一重組體中外源 DNA 的連接方向和插入數量都必須用限制酶酶切圖譜分析或其他方法加以鑒定。作為一般規律，如果連接反應中質粒和目的 DNA 摩爾數相等，而且 DNA 的
在質粒載體中進行平末端片段的克隆實驗
在質粒載體中進行平末端片段的克隆實驗 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 克隆平末端的目的片段時，為最大量地獲得“正確”的連接產物，載體和目的 DNA 在連接反應中的比例必須適當。
在質粒載體(plasmid－vector)中進行平末端片段的克隆
1、分別設立兩個反應，用適當的限制性內切核酸酶消化1－10μg質粒DNA和外源DNA片段，使它們能產生平末端。2、苯酚：氯仿抽提與乙醇沉淀法純化出已被消化的載體和外源DNA片段。3、分別用TE（pH 8.0）重新溶解純化出的兩種DNA沉淀，使終濃度為100 ng/ml。假設1 bp相當于660Da，
外源DNA片段在質粒載體中的克隆實
實驗方法原理?限制性內切酶可識別特定位點并切割DNA產生粘性末端或平端的外源片段，經DNA的純化處理后用于連接反應；選擇克隆載體pUC18多克隆位點上相應的限制性內切酶切割，并用堿性磷酸酶處理防止載體自連；在連接酶的作用下將外源片段連接到載體上，實現外源片段的克隆。實驗材料?DNA片段PUC18試劑
外源DNA片段在質粒載體中的克隆實驗
克隆法 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 限制性內切酶可識別特定位點并切割DNA產生粘性末端或平端的外源片段，經DNA的純化處理后用于連接反應；選擇克隆載體pUC18多克隆位點上
外源DNA片段在質粒載體中的克隆實驗
NA重組技術包括載體及外源DNA片段的酶切消化、目的片段的獲得及純化、目的片段與克隆載體的體外連接、重組子的篩選和鑒定等內容。主要用于（1）外源性基因轉染；（2）對外源性基因的轉化分離。實驗方法原理限制性內切酶可識別特定位點并切割DNA產生粘性末端或平端的外源片段，經DNA的純化處理后用于連接反應；
外源DNA片段在質粒載體中的克隆實驗原理和步驟
DNA重組技術包括載體及外源DNA片段的酶切消化、目的片段的獲得及純化、目的片段與克隆載體的體外連接、重組子的篩選和鑒定等內容。DNA片段的克隆技術是分子操作的核心部分。 實驗目的： 學習DNA的酶切、純化及外源片段與載體的連接，將BAC克隆所攜帶的外源DNA酶切片段亞克隆到pUC18載體上
在質粒載體中進行定向克隆實驗
在質粒載體中進行定向克隆實驗 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 大多數常用質粒都含有可被不同內切酶識別的多克隆位點。由于可供選擇的克隆位點很多 [ 如 Invitrogen 公司
在質粒載體中進行定向克隆實驗
大多數常用質粒都含有可被不同內切酶識別的多克隆位點。由于可供選擇的克隆位點很多 [ 如 Invitrogen 公司的 PSE280 質粒的克隆位點有 46 個之多，而且還可以設計含有更多克隆位點的多聚接頭（Brosius 1992 ) ]，因此一般來說總是能夠找到一個帶有與某一特定外源 DNA 片段
在質粒載體中進行定向克隆實驗
實驗方法原理 大多數常用質粒都含有可被不同內切酶識別的多克隆位點。由于可供選擇的克隆位點很多 [ 如 Invitrogen 公司的 PSE280 質粒的克隆位點有 46 個之多，而且還可以設計含有更多克隆位點的多聚接頭（Brosius 1992 ) ]，因此一般來說總是能夠找到一個帶有與某一
PCR產物的平末端克隆
常規采用的技術路線，實驗一般利用噬菌體 T4 DNA 聚合酶等補平擴增 DNA 片段的末端（Weiner 1993; Chuang et al. 1995)。Liu 與 Schwartz (1992) 發現在連接反應的溫育過程中，當反應液中存在過量的限制性內切核酸酶能顯著地增加重組質粒的產率
PCR產物的平末端克隆
靶基因經 PCR 擴增，樣品進行必要的純化回收后，接下來用平末端進行連接克隆也是分子生物學實驗中常規采用的技術路線，實驗一般利用噬菌體 T4 DNA 聚合酶等補平擴增 DNA 片段的末端（Weiner 1993; Chuang et al. 1995)。本實驗來源「分子克隆實驗指南第三版」黃培堂等譯
PCR產物的平末端克隆
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 靶基因經 PCR 擴增，樣品進行必要的純化回收后，接下來用平末端進行連接克隆也是分子生物學實驗中常規采用的技術路線，實驗一般利用噬菌體 T4 DNA 聚合酶等補平擴增 DNA 片段的末端（Weiner 1993; Chuan
高容量載體中基因組DNA片段末端的分離(小載體PCR)
許多真核生物的基因所包含的 DNA，遠非單個重組子所能容納得了的。對于大多數染色體來說，更是如此。因此，必須構建一套重疊的 DNA 克隆，這些克隆的 DNA 按次序排列能形成疊連序列（疊連群），可以涵蓋一個很大的基因或目的區域。本實驗來源「分子克隆實驗指南第三版」黃培堂等譯。 實驗方法
高容量載體中基因組DNA片段末端的分離(小載體PCR)
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 許多真核生物的基因所包含的 DNA，遠非單個重組子所能容納得了的。對于大多數染色體來說，更是如此。因此，必須構建一套重疊的 DNA 克隆，這些克隆的 DNA 按次序排列能形成疊連序列（疊連群），可以涵蓋一個很大的基因或目的區域。
高容量載體中基因組DNA片段末端的分離(小載體PCR)
實驗方法原理 許多真核生物的基因所包含的 DNA，遠非單個重組子所能容納得了的。對于大多數染色體來說，更是如此。因此，必須構建一套重疊的 DNA 克隆，這些克隆的 DNA 按次序排列能形成疊連序列（疊連群），可以涵蓋一個很大的基因或目的區域。實驗材料 T4 噬菌體 DNA 連接酶限制性內切核酸酶 P
克隆在原核載體的DNA片段的快速鑒定
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 已轉化的重組載體的細菌細胞或 λ 噬菌體顆粒可通過直接從培養皿上挑取菌落或噬菌斑獲得，然后直接加入到 PCR 混合液中，這時 PCR 混合液中含有除了未加熱穩定 DNA 聚合酶外的所有試劑，其中引物與所要鑒定的已克隆 DNA
克隆在原核載體的DNA片段的快速鑒定
實驗方法原理 已轉化的重組載體的細菌細胞或 λ 噬菌體顆粒可通過直接從培養皿上挑取菌落或噬菌斑獲得，然后直接加入到 PCR 混合液中，這時 PCR 混合液中含有除了未加熱穩定 DNA 聚合酶外的所有試劑，其中引物與所要鑒定的已克隆 DNA 片段的側翼序列互補。實驗材料 熱穩定 DNA 聚合酶正義和反
克隆在原核載體的DNA片段的快速鑒定
已轉化的重組載體的細菌細胞或 λ 噬菌體顆粒可通過直接從培養皿上挑取菌落或噬菌斑獲得，然后直接加入到 PCR 混合液中，這時 PCR 混合液中含有除了未加熱穩定 DNA 聚合酶外的所有試劑，其中引物與所要鑒定的已克隆 DNA 片段的側翼序列互補。本實驗來源「分子克隆實驗指南第三版」黃培堂等譯。實驗方
重組質粒(dna－recombinant－plasmid)的連接
質粒具有穩定可靠和操作簡便的優點。如果要克隆較小的DNA 片段( ＜10kb) 且結構簡單，質粒要比其它任何載體都要好。在質粒載體上進行克隆，從原理上說是很簡單的，先用限制性內切酶切割質粒DNA 和目的DNA 片段，然后體外使兩者相連接，再用所得到重組質粒轉化細菌，即可完成。但在實際工作中，
DNA重組技術－連接
實驗概要? ? ? ? 體外連接獲得重組分子，用于轉化受體細胞。實驗原理? ? 質粒具有穩定可靠和操作簡便的優點。如果要克隆較小的DNA片段(＜10kb)且結構簡單，質粒要比其它任何載體都要好。在質粒載體上進行克隆，從原理上說是很簡單的，先用限制性內切酶切割質粒DNA和目的DNA片段， ?然后體外使
重組質粒（dna－recombinant－plasmid）的連接、轉化及篩選1
第一節 概 述質粒具有穩定可靠和操作簡便的優點。如果要克隆 較小的DNA 片段(＜10kb)且結構簡單,質粒要比其它任何載體都要好。在質粒載體上進行克隆 ,從原理上說是很簡單的，先用限制性內切酶切割質粒DNA 和目的DNA 片段, 然后體外使兩者相連接, 再用所得到重組質粒轉化細菌,即可完成
重組質粒的連接、轉化及篩選
第一節 概 述質粒具有穩定可靠和操作簡便的優點。如果要克隆 較小的DNA 片段(＜10kb)且結構簡單,質粒要比其它任何載體都要好。在質粒載體上進行克隆 ,從原理上說是很簡單的，先用限制性內切酶切割質粒DNA 和目的DNA 片段, 然后體外使兩者相連接, 再用所得到重組質粒轉化細菌,即可完成。但在實
重組質粒的連接、轉化及篩選
第一節 概 述質粒具有穩定可靠和操作簡便的優點。如果要克隆 較小的DNA 片段(＜10kb)且結構簡單,質粒要比其它任何載體都要好。在質粒載體上進行克隆 ,從原理上說是很簡單的，先用限制性內切酶切割質粒DNA 和目的DNA 片段, 然后體外使兩者相連接, 再用所得到重組質粒轉化細菌,即可
外源ＤＮＡ片段未的性質
１．帶有非互補突出端的片段 用兩種不同的限制酶進行消化可以產生帶有非互補突出端的片段，刀就是最容蜴 克隆的片段。常用的大多數質粒載體均帶有由幾個不同限制酶的識別序列組成的多克隆位點。由于現有的多克隆位點如此多樣，因而幾乎總是能找到一種帶有與外ＤＮＡ片段未匹配的限制切位點的載體。于是，采用所謂的定向
用核酸內切酶構建亞克隆
實驗概要所謂亞克隆就是對已經獲得的目的DNA片段進行重新克隆，其目的在于對目的DNA進行進一步分析，或者進行重組改造等。亞克隆的基本過程包括：(1)目的DNA片段和載體的制備；(2)目的DNA片段和載體的連接；(3)連接產物的轉化；(4)重組子篩選。主要試劑1．LB液體培養基：胰化蛋白胨（細菌培養用
PCR技術（十）：PCR產物克隆方法
平端連接 通常情況下，PCR產物可直接與平端載體DNA進行連接，但其連接效 率效低。因為TaqDNA聚合酶具有非模板依賴性末端轉移酶活性，能 在兩6條DNA鏈的3'末端加上一個多余的堿基，使合成的PCR產物成為 3'突出一個堿基的DNA分子。這種DNA分子的連接效率很低。由于PCR