DNA連接反應
（一）外源ＤＮＡ和質粒載體的連接反應 外源ＤＮＡ片段和線狀質粒載體的連接，也就是在雙鏈ＤＮＡ５'磷酸和相鄰的3'羥基之間 形成的新的共價鏈。如質粒載體的兩條鏈都帶5'磷酸，可生成４個新的磷酸二酯鏈。但如果質粒ＤＮＡ已去磷酸化，則吸能形成２個新的磷酸二酯鏈。在這種情況下產生的兩個雜交體分子帶有２個單鏈切口，當雜本導入感受態細胞后可被修復。相鄰的５'磷酸和３'羥基間磷酸二酯鍵的形成可在體外由兩種不同的ＤＮＡ連接酶催化，這兩種酶就是大腸桿菌ＤＮＡ連接酶和Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶。實際上在有克隆用途中，Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶都是首選的用酶。這是因為在下沉反應條件下，它就能有效地將平端ＤＮＡ片段連接起來。 ＤＮＡ一端與另一端的連接可認為是雙分子反應，在標準條件下，其反應速度完全由互相匹配的ＤＮＡ末端的濃度決定。不論末端位于同一ＤＮＡ分子（分子內連接）還是位于不同分子（分子間連接），都是如此。現考慮......閱讀全文
DNA連接反應
（一）外源ＤＮＡ和質粒載體的連接反應 外源ＤＮＡ片段和線狀質粒載體的連接，也就是在雙鏈ＤＮＡ５'磷酸和相鄰的3'羥基之間 形成的新的共價鏈。如質粒載體的兩條鏈都帶5'磷酸，可生成４個新的磷酸二酯鏈。但如果質粒ＤＮＡ已去磷酸化，則吸能形成２個新的磷酸二酯鏈。在這種情況下產生的
DNA連接反應的影響因素
1、 連接緩沖液的影響：大體上緩沖液含有以下組分：20-100mmol/L的Tris-HCl，較多用50mmol/L，pH的范圍在7.4-7.8，較多用7.8，目的是提供合適酸堿度的連接體系；10mmol/L的MgCl2，作用是激活酶反應；1-20mmol/L的DTT，較多用10mmol/L，作用是
DNA的定#63870;與連接反應方法步驟
藥品試劑：純化的gusA 片段及pQE31 BamHI/HindIII 片段1% 6-well agarose gelDNA 標準分子量 （λMr, 0.5 μg/μL）方法步驟：1） 取4 支微量離心管，依下表加入DNA, TE-8.0 及追蹤染劑 （μL）：2） 短暫離心混合后，將各管樣品置65
外源DNA和質粒載體的連接反應
外源ＤＮＡ片段和線狀質粒載體的連接，也就是在雙鏈ＤＮＡ５'磷酸和相鄰的3'羥基之間 形成的新的共價鏈。如質粒載體的兩條鏈都帶5'磷酸，可生成４個新的磷酸二酯鏈。但如果質粒ＤＮＡ已去磷酸化，則吸能形成２個新的磷酸二酯鏈。在這種情況下產生的兩個雜交體分子帶有２個單鏈切口，當雜本導
質粒載體和外源DNA的連接反應
實驗概要掌握DNA體外連接的基本技能，了解連接反應的注意事項。實驗原理DNA片段之間的連接是通過DNA連接酶的催化實現的。DNA連接酶催化具有平末端或互補粘性末端的DNA片段間相鄰堿基通過3’,5’磷酸二酯鍵連接起來，該反為需能反應，通常需要加入ATP或NADH，DNA連接酶對粘性末端的連接效率要遠
外源DNA和質粒載體的連接反應
外源ＤＮＡ片段和線狀質粒載體的連接，也就是在雙鏈ＤＮＡ５'磷酸和相鄰的3'羥基之間 形成的新的共價鏈。如質粒載體的兩條鏈都帶5'磷酸，可生成４個新的磷酸二酯鏈。但如果質粒ＤＮＡ已去磷酸化，則吸能形成２個新的磷酸二酯鏈。在這種情況下產生的兩個雜交體分子帶有２個單鏈切口，當雜本導
質粒載體和外源DNA的連接反應
實驗原理DNA片段之間的連接是通過DNA連接酶的催化實現的。DNA連接酶催化具有平末端或互補粘性末端的DNA片段間相鄰堿基通過3’,5’磷酸二酯鍵連接起來，該反為需能反應，通常需要加入ATP或NADH，DNA連接酶對粘性末端的連接效率要遠高于對平末端的連接效率。在基因基因工程實驗中，最常用的來源于T
分子克隆技術(質粒DNA和DNA插入片段的制備、連接反應...1
克隆（Clone）是指通過無性繁殖過程所產生的與親代完全相同的子代群體。分子克隆（Molecular Cloning）是指由一個祖先分子復制生成的和祖先分子完全相同的分子群，發生在基因水平上的分子克隆稱基因克隆（DNA克隆）。其基本原理是：將編碼某一多肽或蛋白質的基因（外源基因）組裝到細菌質粒（
分子克隆技術(質粒DNA和DNA插入片段的制備、連接反應...2
PCR引物決定PCR的特異性，引物的設計就顯得尤為重要。下面以已知DNA序列設計引物為例介紹設計引物應考慮的幾個方面：1、GC比值：眾所周知,堿基對中的GC之間有三條氫鍵，AT之間有兩條氫鍵，GC和AT在引物序列中的合理比例是設定PCR中退火溫度的重要依據。通常在一個引物中GC和AT各半即可。2、長
質粒載體連接反應
連接反應（一）外源ＤＮＡ和質粒載體的連接反應 外源ＤＮＡ片段和線狀質粒載體的連接，也就是在雙鏈ＤＮＡ５'磷酸和相鄰的3'羥基之間 形成的新的共價鏈。如質粒載體的兩條鏈都帶5'磷酸，可生成４個新的磷酸二酯鏈。但如果質粒ＤＮＡ已去磷酸化，則吸能形成２個新的磷酸二酯鏈。在這種情況
外源DNA和質粒載體的連接反應原理及實驗步驟2
10xT4噬菌體DNA連接酶緩沖液200mmol/L同Tris.Cl(pH7.6)50mmol/K MgCl250mmol/L二硫蘇糖醇500μg/ml 牛血清白蛋白（組分Ｖ.Sigma產品）（可用可不用）該緩訓液應分裝成小份，貯存于－20℃。另外，再設立兩個對照反應，其中含有（1）只有質粒載體；（
外源DNA和質粒載體的連接反應原理及實驗步驟1
外源DNA片段和線狀質粒載體的連接，也就是在雙鏈DNA５'磷酸和相鄰的3'羥基之間 形成的新的共價鏈。如質粒載體的兩條鏈都帶5'磷酸，可生成4個新的磷酸二酯鏈。但如果質粒DNA已去磷酸化，則吸能形成2個新的磷酸二酯鏈。在這種情況下產生的兩個雜交體分子帶有2個單鏈切口，當雜
用－PCR－分析連接反應的底物和產物
? ? ? ? ? ? 試劑、試劑盒 ddH2O Vent 緩沖液 Vent DNA 聚合酶 dNTP 引物 質粒 DNA
用－PCR－分析連接反應的底物和產物
由 PCR 產生的合成 DNA 文庫，可以經過酶切消化，連接到線性化的表達載體系統上。在這里所列的方案中，文庫的 5’（NotⅠ）和 3'(ClaⅠ) 末端是不同的酶切位點，也用同樣的酶切位點克隆進載體。可以用 PCR 分析線性化反應和連接反應的效率。本實驗來源于 PCR 實驗指南（第二版）
用－PCR－分析連接反應的底物和產物
試劑、試劑盒?ddH2OVent 緩沖液Vent DNA 聚合酶dNTP引物質粒 DNA儀器、耗材?瓊脂糖凝膠電泳所需的試劑和設備熱循環儀實驗步驟?一、材料1. 緩沖液、溶液和試劑ddH2O2. 酶和酶緩沖液10X Vent 緩沖液Vent DNA 聚合酶3. 核酸和寡核苷酸dNTP，各 20 mm
雙酶切連接反應之全攻略
前一陣子一直在做雙酶切質粒重組，失敗了 很多次，不過很快改善了 實驗方法，用2周重組了 14個質粒。現就自己的體會，結合丁香園戰友的寶貴經驗，談一下質粒重組的一些個人經驗。1、回收PCR產物：在進行PCR擴增時候，給引物兩端設計好酶切位點，一般說來，限制酶的 選擇非常重要，盡量選擇粘端酶切和 那些酶
雙酶切連接反應之全攻略
在進行PCR擴增時候，給引物兩端設計好酶切位點，一般說來，限制酶的 選擇非常重要，盡量選擇粘端酶切和 那些酶切效率高的限制酶，如BamHI、HindIII，提前看好各公司的雙切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。選好酶切位點后，在各個酶的兩邊加上保護堿基，其原則可
DNA重組技術－連接
實驗概要? ? ? ? 體外連接獲得重組分子，用于轉化受體細胞。實驗原理? ? 質粒具有穩定可靠和操作簡便的優點。如果要克隆較小的DNA片段(＜10kb)且結構簡單，質粒要比其它任何載體都要好。在質粒載體上進行克隆，從原理上說是很簡單的，先用限制性內切酶切割質粒DNA和目的DNA片段， ?然后體外使
DNA連接試驗
當我們已經獲得目的基因片段，選擇好適當的克隆（或表達，轉化）質粒載體， 并確定重組方案后，下面要進行的就是ＤＮＡ片段之間的體外連接，從而獲得重組子。 此重組子可轉入相應的宿主菌中用于對目的基因的擴增以及目的基因表達（如現代基因工程藥物的生產），還可用于序列分析和轉基因等重要生物技術的研究中。?DNA
DNA的重組連接
目的：了解T4DNA連接酶的幾種生物學功能及用途；學習在T4DNA連接酶的作用下，載體與目的基因的幾種不同的連接方式以及在標準的連接反應體系中，質粒載體和插入的外源DNA的比率關系和各自的用量；掌握用Pmd18-Tvector與PCR產物進行T-A克隆的機理及其應用。原理：外源DNA片段和線狀質粒載
在質粒載體中進行平末端片段的克隆實驗
克隆平末端的目的片段時，為最大量地獲得“正確”的連接產物，載體和目的 DNA 在連接反應中的比例必須適當。每一重組體中外源 DNA 的連接方向和插入數量都必須用限制酶酶切圖譜分析或其他方法加以鑒定。作為一般規律，如果連接反應中質粒和目的 DNA 摩爾數相等，而且 DNA 的總濃度少于 100 μg/
PCR產物的平末端克隆
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 靶基因經 PCR 擴增，樣品進行必要的純化回收后，接下來用平末端進行連接克隆也是分子生物學實驗中常規采用的技術路線，實驗一般利用噬菌體 T4 DNA 聚合酶等補平擴增 DNA 片段的末端（Weiner 1993; Chuan
PCR產物的平末端克隆
常規采用的技術路線，實驗一般利用噬菌體 T4 DNA 聚合酶等補平擴增 DNA 片段的末端（Weiner 1993; Chuang et al. 1995)。Liu 與 Schwartz (1992) 發現在連接反應的溫育過程中，當反應液中存在過量的限制性內切核酸酶能顯著地增加重組質粒的產率
重組質粒(dna－recombinant－plasmid)的連接
質粒具有穩定可靠和操作簡便的優點。如果要克隆較小的DNA 片段( ＜10kb) 且結構簡單，質粒要比其它任何載體都要好。在質粒載體上進行克隆，從原理上說是很簡單的，先用限制性內切酶切割質粒DNA 和目的DNA 片段，然后體外使兩者相連接，再用所得到重組質粒轉化細菌，即可完成。但在實際工作中，
TA克隆常見問題分析及其解決方案
TA克隆常見問題分析及其解決方案?問 題 可能的原因 建 議?轉化后無?克隆菌產生 轉化過程有問題或感受態細胞失活 可通過轉化pUC18/19等未切割的可用于抗性篩選的質粒，檢測感受態細胞的轉化效率和轉化操作是否正確?插入對照DNA片段的陽性率低?10×快速連接緩沖?液稀釋不當 提供的T4 連接酶緩
PCR產物的平末端克隆
靶基因經 PCR 擴增，樣品進行必要的純化回收后，接下來用平末端進行連接克隆也是分子生物學實驗中常規采用的技術路線，實驗一般利用噬菌體 T4 DNA 聚合酶等補平擴增 DNA 片段的末端（Weiner 1993; Chuang et al. 1995)。本實驗來源「分子克隆實驗指南第三版」黃培堂等譯
在質粒載體中進行平末端片段的克隆實驗
實驗方法原理 克隆平末端的目的片段時，為最大量地獲得“正確”的連接產物，載體和目的 DNA 在連接反應中的比例必須適當。每一重組體中外源 DNA 的連接方向和插入數量都必須用限制酶酶切圖譜分析或其他方法加以鑒定。作為一般規律，如果連接反應中質粒和目的 DNA 摩爾數相等，而且 DNA 的
DNA的重組連接實驗原理和步驟
一、實驗目的 用T4DNA連接酶將載體pBR322 EcoR Ⅰ-CIP處理的DNA片段，與目的基因5.4KbEcoR Ⅰ片段連接起來，構建體外重組DNA分子，同時學習幾種DNA連接的方法。 二、實驗原理 重組的DNA分子是在T4DNA連接酶的作用下，有Mg
雙酶切連接反應全攻略和個人經驗總結
前一陣子一直在做雙酶切質粒重組，失敗了很多次，不過很快改善了 實驗方法，用2周重組了14個質粒。現就自己的體會，結合前人的寶貴經驗，談一下質粒重組的一些個人經驗。1、回收PCR產物：在進行PCR擴增時候，給引物兩端設計好酶切位點，一般說來，限制酶的選擇非常重要，盡量選擇粘端酶切和那些酶切效率高的限制
體外DNA重組技術5
（三）DNA酶切片段的回收【實驗方法與步驟】1.凍融法:（1）在UV燈下，用手術刀片將含DNA片段的瓊脂糖凝膠切下，-70℃冷凍至少 15min，然后在65℃水浴中使膠融化；（2）加入等倍體積TE-飽和酚，劇烈振蕩30秒鐘，然后-70℃冷凍 15min；（3）室溫融化后，12,000rpm離心5mi