雙向電泳的實驗過程
一、 實驗原理：2-DE的第一向電泳等電聚焦是基于等電點不同而將蛋白粗步分離，第二向SDS-PAGE是基于蛋白質分子量不同，而將一向分離后的蛋白進一步分離。這樣就可以得到蛋白質等電點和分子量的信息。二、 實驗步驟：1. 樣品的溶解取純化后的晶體蛋白3.0mg，加入300ul裂解液(1mg蛋白:100ul裂解液)振蕩器上振蕩10min左右，共處理一個小時。其中每隔10～15分鐘振蕩一次，然后13200rpm離心15min除雜質，取上清分裝，每管70ul，—80oC保存。2. Bradford法測蛋白含量取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超純水溶解,測定BSA標準曲線及樣品蛋白含量。 取7個10ml的離心管，首先在5個離心管中按次序加入0ul, 5ul, 10ul, 15ul, 20ul ......閱讀全文
影響雙向電泳分離效果的若干實驗條件比較研究（二）
2．2 還原樣品中巰基的影響圖2、圖3分別為肝細胞樣品和牛奶樣品加還原劑后加與不加巰基保護劑的電泳結果比較．與圖2(a)、圖2(b)比較，圖2(c)斑點數量明顯減少，還出現一些假斑點．與圖3(a)比較，圖3(b)點2和3消失，也出現4和5兩個假斑點．斑點減少是因為加還原劑打開二硫鍵后形成的巰基若未及
雙向電泳的原理和特點
雙向電泳（two-dimensional electrophoresis,2-DE）是等電聚焦電泳和SDS-PAGE的組合，即先進行等電聚焦電泳（按照pH分離），然后再進行SDS-PAGE（按照分子大小），經染色得到的電泳圖是個二維分布的蛋白質圖。蛋白質組研究的發展以雙向電泳技術作為核心。雙向電泳由
雙向電泳的送樣要求
1、 樣品新鮮。說明：組織樣本及細胞采樣后應立即放入液氮中速凍或加入樣品穩定劑，運輸過程中血液、血清樣品4℃保存，其它樣品-20℃保存，不超過48小時（若外地郵寄，除血液、血清及細胞外請用干冰）。2、 樣品蛋白的總量不少于1mg。說明：組織樣本每份約250-500mg；細胞樣品每份106—107細胞
雙向電泳完整的操作步驟
（一）第一向等電聚焦?1. 從冰箱中取-20℃冷凍保存的水化上樣緩沖液（I）（不含DTT，不含Bio-Lyte）一小管（1ml/管），置室溫溶解。?2. 在小管中加入0.01g DTT， Bio-Lyte 4-6、5-7各2.5ml，充分混勻。?3. 從小管中取出400ml水化上樣緩沖液，加入100
雙向電泳完整的操作步驟
（一）第一向等電聚焦1.從冰箱中取-20℃冷凍保存的水化上樣緩沖液（I）（不含DTT,不含Bio-Lyte）一小管（1ml/管）,置室溫溶解.2.在小管中加入0.01g DTT,Bio-Lyte 4-6、5-7各2.5ml,充分混勻.3.從小管中取出400ml水化上樣緩沖液,加入100ml樣品,充分
達爾文的實驗過程
達爾文的實驗過程：1，胚芽鞘受到單側光照射。現象為：彎向光源生長。2，切去胚芽鞘的頂端。現象為：胚芽鞘既不生長，也不彎曲。3，用錫箔小帽罩住胚芽鞘的頂端。現象為：胚芽鞘直立生長。4，用錫箔套住胚芽鞘尖端下面一段，單側光照射胚芽鞘尖端。現象為：胚芽仍然彎向光源生長。總體達爾文的推論為：胚芽鞘尖端感受單
植物蛋白質組學中的雙向電泳技術實驗
試劑、試劑盒尿素裂解溶液IPG 干膠條水化液IPG 膠條平衡液SDS 凝膠緩沖液電極緩沖液儲液丙烯酰胺 甲叉雙丙烯酰胺溶液過硫酸銨溶液瓊脂糖溶液儀器、耗材等電聚焦儀IPGphor多重垂直 SDS 電泳儀實驗步驟3.1 第一向：在 IPG 膠條中進行等電聚焦（ IPG-IEF)采用 IPG ( IPG
植物蛋白質組學中的雙向電泳技術實驗
試劑、試劑盒尿素裂解溶液 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?? IPG 干膠條水化液 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?
雙向電泳:清洗IEF管
1．IEF之后，用去離子水充分地清洗管子。2．加熱500ml 0.6％?Deconex溶液至60～80℃。3．將玻璃管子浸入Deconex溶液，70℃下放置3次10分鐘：每10分鐘之后，分別用鑷子移走玻璃管，倒出清洗液，加入新的清洗液，再于70℃下清洗10分鐘。4．用去離子水浸洗管子。5．加熱500
雙向電泳完整操作步驟
（一）第一向等電聚焦1. 從冰箱中取-20℃冷凍保存的水化上樣緩沖液（I）（不含DTT，不含Bio-Lyte）一小管（1ml/管），置室溫溶解。2. 在小管中加入0.01g DTT， Bio-Lyte 4-6、5-7各2.5ml，充分混勻。3. 從小管中取出400ml水化上樣緩沖液，加入100ml樣
雙向電泳完整操作步驟
（一）第一向等電聚焦1. 從冰箱中取-20℃冷凍保存的水化上樣緩沖液（I）（不含DTT，不含Bio-Lyte）一小管（1ml/管），置室溫溶解。2. 在小管中加入0.01g DTT， Bio-Lyte 4-6、5-7各2.5ml，充分混勻。3. 從小管中取出400ml水化上樣緩沖液，加入100ml樣
雙向電泳儀的研究方向
隨著技術的飛速發展，已能分離出10 000個斑點（spot）。 當雙向電泳斑點的全面分析成為現實的時候，蛋白質組的分析變得可行。樣品制備（sample prepareation）和溶解同樣事關2-DE的成效，目標是盡可能擴大其溶解度和解聚，以提高分辨率。用化學法和機械裂解法破碎以盡可能溶解和解聚蛋白
植物蛋白質組學中的雙向電泳技術實驗（四）
3.3 第二向：多重垂直 SDS-PAGESDS-PAGE 可以在水平或垂直系統上進行 [29] 。水平設備適用于預制膠（ExcelGel SDS；Amersham Biosciences/ GE Healthcare) 。而垂直系統則應用于多塊膠平行進行的電泳中，尤其是大規模的蛋白質組分析
植物蛋白質組學中的雙向電泳技術實驗（一）
試劑、試劑盒?尿素裂解溶液IPG 干膠條水化液IPG 膠條平衡液SDS 凝膠緩沖液電極緩沖液儲液丙烯酰胺 甲叉雙丙烯酰胺溶液過硫酸銨溶液瓊脂糖溶液儀器、耗材?等電聚焦儀 IPGphor多重垂直 SDS 電泳儀實驗步驟 3.1 第一向：在 IPG 膠條中進行等電聚焦（ IPG-IEF)采用 IPG (
植物蛋白質組學中的雙向電泳技術實驗（三）
使用 IPGphor 進行 IEF 的典型工作條件見表13-2和 表 13-3 。正如前文指出的那樣 ，為了使高分子質量的蛋白質更好地進入聚丙烯酰胺膠內，水化時應在膠條兩端加低電壓（30~50 V ) ，否則將給水化上樣造成困難[ 15，28] 。然后電壓逐步升高至 8000 V。如果 IP
植物蛋白質組學中的雙向電泳技術實驗（二）
2. 在平板儀器上進行 IPG-IEF ( Multiphor ll Unit)滿足下列條件時，水化后的 IPG 膠條可以直接放在 IEF 儀器的冷卻板上：① 如果運行時間不超過 12 h ( 經常發生在寬的或中等 pH 范 圍 IPG，如 IPG 3~10 或 4~7 ) 。② 如果 pH 梯
雙向電泳原理及操作步驟
實驗概要本文介紹了雙向電泳原理及操作步驟（第一向等電聚焦和第二向SDS-PAGE電泳）。實驗原理二維聚丙烯酰胺凝膠電泳技術結合了等電聚焦技術（根據蛋白質等電點進行分離）以及SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳技術（根據蛋白質的大小進行分離）。這兩項技術結合形成的二維電泳是分離分析蛋白質最有效的一種電泳手段。通
蛋白質技術——雙向電泳
實驗概要蛋白質組研究的發展以雙向電泳技術作為核心. ?雙向電泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分離約1000個E.coli蛋白，并表明蛋白質譜不是穩定的，而是隨環境而變化. ?雙向電泳原理簡明，第一向進行等電聚焦，蛋白質沿pH梯度分離，至各自的等電點；隨后，再沿垂直的方向進行分子
雙向電泳儀的常見問題
重泡脹后的膠可以不用轉移到另一個電泳槽，直接跑 2D 的一向嗎？一般情況下是可以的。但當上樣量特別大時，可能會有一部分蛋白質沒有被膠條吸收，這樣跑完 1D 和 2D 膠后，會有很多橫向條紋。所以在這種情況下，最好在重泡脹后，將膠條轉移到另外一個電泳漕中進行電泳。為什么我在等電聚焦前加的礦物油在聚焦后
雙向電泳的常見問題解析
重泡脹后的膠可以不用轉移到另一個電泳槽，直接跑 2D 的一向嗎？一般情況下是可以的。但當上樣量特別大時，可能會有一部分蛋白質沒有被膠條吸收，這樣跑完 1D 和 2D 膠后，會有很多橫向條紋。所以在這種情況下，最好在重泡脹后，將膠條轉移到另外一個電泳漕中進行電泳。為什么我在等電聚焦前加的礦物油在聚焦后
雙向電泳法的基本原理
蛋白質首先在薄條凝膠中通過等電聚焦分離。然后將凝膠水平放置在第二個平板狀凝膠上，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質。水平分離反映了pI的差異；垂直分離反映了分子量的差異。因此，原始的蛋白質組成在兩個維度上擴散。使用雙向電泳技術可以分解數千種細胞蛋白質。可以從凝膠中切取出單個蛋白質點，并通過質譜
ELISA實驗新手應了解的實驗過程
1．從已平衡至室溫的密封袋中取出實驗所需板條，未用的板條和干燥劑請放回鋁箔袋內壓 實自封條，密封口袋，放回4℃。2．空白孔加規范品和標本稀釋液，其他相應孔中加標本或不同濃度規范品(100ul/孔)，用封板膠紙封住反響孔，36℃孵箱孵育90分鐘。 3．提早20分鐘預備生物素化抗體工作液。 4．洗板5次
ELISA實驗原理及實驗過程
實驗原理ELISA是以免疫學反應為基礎，將抗原、牽9體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結合起來的一種敏感性很高的試驗技術。由于抗原、抗體的反應在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進行，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌除去多余的游離反應物，從而保證試驗結果的特異性與穩定性。在實際應用中，通
滴定儀的實驗過程
通過測量電極電位變化，來測量離子濃度。 1.組成工作電池：選用適當的指示電極和參比電極，與被測溶液組成一個工作電池， 2.加入滴定劑進行反應：在滴定過程中，由于發生化學反應，被測離子的濃度不斷發生變化，因而指示電極的電位隨之變化。 3.離子突變，電位突躍，確定終點：在滴定終點附近，被測離
滴定儀的實驗過程
通過測量電極電位變化，來測量離子濃度。 1.組成工作電池：選用適當的指示電極和參比電極，與被測溶液組成一個工作電池， 2.加入滴定劑進行反應：在滴定過程中，由于發生化學反應，被測離子的濃度不斷發生變化，因而指示電極的電位隨之變化。 3.離子突變，電位突躍，確定終點：在滴定終點附近，被測離子
核酸探針標記的實驗過程
?實驗原理分子生物研究中，zui常用的探針即為雙鏈DNA探針，它廣泛應用于轉基因植物拷貝數的鑒定、臨床診斷等方面。雙鏈DNA探針的合成方法主要有下列兩種:切口平移法和隨機引物合成法。切口平移法(nick translation) 當雙鏈DNA分子的一條鏈上產生切口時,E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可
免疫共沉淀的實驗過程
（1）轉染后24-48 h 可收獲細胞，加入適量細胞裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30min, 細胞裂解液于4°C， 最大轉速離心30 min后取上清；（2）取少量裂解液以備Western blot分析，剩余裂解液加1μg相應的抗體加入到細胞裂解液，4°C緩慢搖晃孵育過夜；（3）取10μl
高通量測序的實驗過程
1.樣本準備（sample fragmentation）2.文庫構建(library preparation)3.測序反應(sequencing reaction)4.數據分析(data analysis)
核酸探針標記的實驗過程
實驗原理分子生物研究中，zui常用的探針即為雙鏈DNA探針，它廣泛應用于轉基因植物拷貝數的鑒定、臨床診斷等方面。雙鏈DNA探針的合成方法主要有下列兩種:切口平移法和隨機引物合成法。切口平移法(nick translation) 當雙鏈DNA分子的一條鏈上產生切口時,E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可將
原位PCR實驗的大致過程
大致過程 實驗用的標本是新鮮組織、石蠟包埋組織、脫落細胞、血細胞等。其基本方法為多聚甲醛固定組織或細胞，蛋白酶消化處理組織；在組織細胞片上滴加PCR反應液進行擴增，覆蓋并加液體石蠟后，在原位PCR儀上進行PCR循環擴增，PCR擴增結束后用標記的探針進行原位雜交，最后顯微鏡觀察結果。 實驗玻片