定點誘變(DpnI法)
1、引物設計：每條引物都要攜帶有所需的突變位點，引物一般長25~45bp,設計的突變位點需位于引物中部。2、反應：使用高保真的pyrobest DNA聚合酶 ;循環次數少，一般為12個循環。反應體系：10x pyrobest Buffer 5 uldNTP Mixture(10mM) 1ul 模板DNA(5~50ng) &......閱讀全文
定點誘變實驗
實驗材料 DNA試劑、試劑盒 TE寡核苷酸引物質粒dNTPDNA聚合酶氯仿石蠟油無水乙醇儀器、耗材 離心管熱循環儀離心機實驗步驟 1. ?利用突變區兩側的限制性內切酶位點將待誘變的DNA片段亞克隆進高拷貝數的載體中。?2. ?用小量制備的質粒提取模板DNA，用TE緩沖液重懸100 ng DNA至終濃
定點誘變實驗
基本方案 利用PCR引物點突變 ? ? ? ? ? ? 實驗材料 DNA 試劑、試劑盒
定點誘變(DpnI法)
1、引物設計：每條引物都要攜帶有所需的突變位點，引物一般長25~45bp,設計的突變位點需位于引物中部。2、反應：使用高保真的pyrobest DNA聚合酶 ;循環次數少，一般為12個循環。反應體系：10x pyrobest Buffer ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 5 uldN
定點誘變(DpnI法)
1、引物設計：每條引物都要攜帶有所需的突變位點，引物一般長25~45bp,設計的突變位點需位于引物中部。2、反應：使用高保真的pyrobest DNA聚合酶 ;循環次數少，一般為12個循環。反應體系：10x pyrobest Buffer 5 uldNTP Mixture(10mM) 1ul模板DN
關于基因定點誘變的概述
對于任何一種遺傳學研究，尤其是有關基因的結構與功能的分析，突變都是最基本的手段。經典的方法是，應用能夠修飾DNA分子的化學誘變劑或物理誘變劑處理生物體。此類誘變方法雖然已得到了廣泛的應用，獲得了大量的突變體，但亦存在著諸多的不便之處。 第一、經受誘變劑處理的生物體，它的任何基因都有可能發生突變
定點誘變實驗——基本方案
定點突變是指通過聚合酶鏈式反應（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因組，也可以是質粒）中引入所需變化（通常是表征有利方向的變化），包括堿基的添加、刪除、點突變等。定點突變能迅速、高效的提高DNA所表達的目的蛋白的性狀及表征，是基因研究工作中一種非常有用的手段。實驗材料DNA試劑、試劑盒TE寡核
定點誘變實驗——利用PCR引物點突變
實驗材料DNA試劑、試劑盒DNA聚合酶klenow限制性內切酶儀器、耗材水浴鍋離心機培養箱實驗步驟1. ?制備模板（見基本方案，步驟1和2）?2. ?合成和純化寡核苷酸引物并對5‘端磷酸化。?3. ?擴增模板DNA（基本方案，步驟4和5），在最后一次延伸結束后，加5 U 的klenow酶，30℃保溫
寡核苷酸定點誘變的概念
中文名稱寡核苷酸定點誘變英文名稱oligonucleotidedirected mutagenesis定 義人工獲得特定核酸定點突變的一種方案。將需要改變的核苷酸置于一段合成的寡核苷酸中部，在單鏈噬菌體(如M13)模板上用克列諾酶合成有指定變化的負鏈，再通過噬菌體復制得到含突變的雙鏈。應用學科生物
定點誘變與盒式誘變的比較介紹
構建一個位點導向的文庫涉及使用含有一個或多個簡并密碼子的合成DNA片段替代一個基因片段。這可以通過雙鏈盒式誘變或單鏈寡核苷酸定向誘變來實現。我們相對傾向于寡核苷酸定向誘變，因為不同于盒式誘變，它不需要在目的區域附近有獨特的限制性酶切位點，并且構建一個文庫只需要一個寡核苷酸片段。因此，這個方法相當
分子遺傳學詞匯寡核苷酸定點誘變
中文名稱：寡核苷酸定點誘變英文名稱：oligonucleotide-directed mutagenesis定 義：用人工合成的寡核苷酸在特定位點導致突變。應用學科：遺傳學（一級學科），分子遺傳學（二級學科）
寡聚核苷酸定點誘變技術的基本原理
寡聚核苷酸定點誘變技術是由加拿大的生物化學家M.史密斯（1932）發明的。其基本原理如下：應用寡聚核苷酸進行DNA的定點誘變時，首先要把含有待突變的DNA片段克隆到MI3噬菌體載體中，MI3噬菌體的正鏈可以感染具有纖毛的細菌，并在細菌體內進行復制后，以出芽的形式形成新的帶有正鏈DNA的噬菌體。而存留
利用大引物－PCR－在同一試管中進行高效快速定點誘變實驗
大引物方法最初是由 KAMMANN 等人（1989）建立的，現在的方法是經過許多研究人員包括 Sarkat 和 Sommer (1990,1992), Giebel 和 Spritz(1990)，Landt 等（1990),Marini 等（1993), Picard 等（1994),Ling 和
利用大引物－PCR－在同一試管中進行高效快速定點誘變實驗
? ? ? ? ? ? 試劑、試劑盒 擴增緩沖液 含有四種 dNTP 的混合溶液 熱穩定 DNA 聚合酶 瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠 正向和反向內引物 誘變引物
利用大引物－PCR－在同一試管中進行高效快速定點誘變實驗
試劑、試劑盒 擴增緩沖液含有四種 dNTP 的混合溶液熱穩定 DNA 聚合酶瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠正向和反向內引物誘變引物模板 DNA儀器、耗材 帶屏障裝置的自動移液器用吸頭微型離心機用離心管可調式移液器實驗步驟 材料緩沖液和溶液貯存液，緩沖液和試劑的成分請參閱附錄 1。將貯存液稀釋到合適的濃度
盒式誘變的簡介
盒式誘變(cassette mutagenesis)是一種定點誘變技術，其方法是利用一段人工合成的具有突變序列的雙鏈寡核苷酸片段，取代野生型基因中相應序列。這種誘變的雙鏈寡核苷酸片段是由兩條人工合成的寡核苷酸鏈組成的，當它們退火時，會按照設計要求產生出克隆需要的粘性末端。這些合成的寡核苷酸片段就
用放射性標記的寡核苷酸雜交篩選定點誘變重組克隆實驗
實驗方法原理 試劑、試劑盒 甲酸銨寡核苷酸雜交溶液寡核苷酸預雜交液TE噬菌體T4多核苷酸激酶限制性內切核酸酶瓊脂糖凝膠誘變寡核苷酸[γ-32P]ATP2XYT 頂層瓊脂和 2xYT 瓊脂平皿 儀器、耗材 鈍端鑷子皮下注射用針頭（18 號）和印度墨水孵箱硝酸纖維素膜或尼龍膜真空烤箱68°C 水
用放射性標記的寡核苷酸雜交篩選定點誘變重組克隆實驗
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 試劑、試劑盒 甲酸銨 寡核苷酸雜交溶液 寡核苷酸預雜交液 TE 噬菌體T4多核
用放射性標記的寡核苷酸雜交篩選定點誘變重組克隆實驗
本方案主要描述了篩選噬菌體 M13 重組克隆，而一種選擇方案是篩選含噬菌粒的細菌克隆。最后也介紹了用 PCR 檢測突變體的方法。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）下冊，作者：〔美〕J. 薩姆布魯克 D.W. 拉塞爾。實驗方法原理試劑、試劑盒甲酸銨寡核苷酸雜交溶液寡核苷酸預雜交液TE噬菌體T4多核
關于寡核苷酸引物誘變的介紹
寡核苷酸引物誘變是由加拿大生物化學家Michael Smith發明的一種基因定點誘變方法。其基本原理是：合成一段寡聚脫氧核糖核苷酸作為引物，其中含有需要改變的堿基，使其與帶有目的基因的單鏈DNA配對，合成的引物除短的錯配區外，與目的基因完全互補，然后用DNA聚合酶延伸引物，完成單鏈DNA的復制。
什么是蛋白質設計？
蛋白質設計是新蛋白質分子的合理設計，旨在設計新的活性，行為或目的，并增進對蛋白質功能的基本了解。可以從頭開始設計蛋白質（從頭設計），也可以通過對已知蛋白質結構及其序列進行計算得出的變體進行設計（稱為蛋白質重新設計）。合理的蛋白質設計方法可以預測蛋白質序列，并將其折疊成特定的結構。然后可以通過諸如肽合
簡述細菌性溶血素的結特征
pLY是所有肺炎球菌臨床分離株所表達的一種53kDa蛋白，是革蘭陽性菌的具同源結構和抗原的溶細胞素族中的一員。對克隆的PLY定點誘變確定了有關細胞毒性的關鍵區。鄰近羧基端的11個氨基酸序列是細胞毒性所必需的，這個序列在所有巰基激活毒素中均高度保守，并含有單個半胱氨酸。而其他區域則涉及膜膽固醇結合
蛋白質工程提高穩定性的作用介紹
提高蛋白質的穩定性包括以下幾個方面： （1）延長酶的半壽期； （2）提高酶的熱穩定性； （3）延長藥用蛋白的保存期； （4）抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性喪失。 葡萄糖異構酶（GI）在工業上應用廣泛，為提高其熱穩定性，朱國萍等人在確定第138位甘氨酸(Gly138)為目標氨基酸后，用
何為PCR,說明其原理及其應用
聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期發展起來的體外核酸擴增技術.PCR技術的基本原理 類似于DNA的 天然復制過程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物.PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加
關于盒式誘變法的基本信息介紹
基因工程技術不但可使基因產生特異性位點突變，也可以產生區域性的突變。常用的方法如盒式突變法，又稱片段取代法。這一方法的要點是利用目標基因中所具有的適當的限制性內切酶位點，用人工合成的具有突變序列的寡核苷酸片段(這種合成的片段被稱為盒)，來置換或取代目標基因中的相應序列。這種用于突變的盒可以是任意
蛋白質工程：跨學科研究揭神奇面紗
在基因工程基礎上發展起來的蛋白質工程，被稱為“第二代基因工程”。在亞太地區蛋白質學會主席、北京大學跨院系蛋白質科學中心主任昌增益教授看來，蛋白質工程不僅蘊涵著人類攻克癌癥等生命難題的重大契機，其在產業化上的巨大發展空間也是不言而喻的。 近年來，蛋白質工程研究和應用已遍及醫療、工業、農
生物物理所在金屬蛋白理性設計研究方面獲得進展
11月29日，中科院生物物理所王江云研究組以Probing the Function of the Tyr-Cys Crosslink in Metalloenzymes through the Genetic Incorporation of 3-Methylthiotyros
概述細菌性溶血素的毒力功能
PLY在侵襲性肺炎球菌感染的早期發病機理中具有增強肺炎球菌毒力的多種功能。PLY是最重要的成孔毒素，能破壞構成呼吸道機械屏障的上皮組織。PLY能損害近端下呼吸道的纖毛清除機理，并促進肺炎球菌對破壞的支氣管上皮細胞間隙的粘附，從而促進增殖的細菌進入下呼吸道。 PLY還能損害下呼吸道中的肺泡-毛細
結核桿菌研究新進展：乙酰化修飾圖譜公布
近日，發表于雜志Int J Biochem Cell Biol.上的一篇文章中，來自西南大學和杭州景杰生物科技有限公司的研究者公布了結核分歧桿菌的乙酰化修飾譜圖。近年來科學家都非常有興趣致力于病原微生物的蛋白質翻譯后修飾研究，本文中作者首次全面鑒定了結核分歧桿菌的乙酰化修飾。這也是繼公布首張結合
成對免疫球蛋白樣受體唾液酸識別機制研究獲進展
成對免疫球蛋白樣受體α和β（paired immunoglobulin-like type 2 receptor α/β, PILRα/PILRβ）是參與先天免疫調控的重要表面分子，在不同的物種中高度保守。兩種分子均在胞外“暴露”相似的單個免疫球蛋白樣結構域以結合相應的配體；但結合配體后，卻利用
高福院士PNAS解析重要免疫分子
由中科院微生物研究所高福（George F. Gao）院士領導的研究小組發現，成對免疫球蛋白樣受體α (PILRα)和β (PILRβ)均采用了典型的唾液酸結合性免疫球蛋白樣凝集素(Siglec)折疊方式，為結合唾液酸提供了結構基礎。這些研究結果發表在《美國國家科學院院刊》（PNAS）上。 P