定點誘變(DpnI法)
1、引物設計：每條引物都要攜帶有所需的突變位點，引物一般長25~45bp,設計的突變位點需位于引物中部。2、反應：使用高保真的pyrobest DNA聚合酶 ;循環次數少，一般為12個循環。反應體系：10x pyrobest Buffer 5 uldNTP Mixture(10mM) 1ul模板DNA(5~50ng) 1ulprimer 1 (125ng) 1ulprimer 2 (125ng) 1ulpyrobest DNA polymerase（TaKaRa）(5U/ul) 0.25ul加無菌蒸餾水至 50ul 3、產物沉淀純化：加1/10 體積的醋酸鈉，1倍體積的異丙醇，混勻置冰上（或-20゜C冰箱）5min,離心棄上清，70~75%乙醇洗鹽兩次，烘干后溶于無菌水中。（此步可省略，直接用 DpnI酶切） 4、DpnI酶切：Buffer 2ul BSA（100╳） 0.2ul DNA x ul Dp......閱讀全文
定點誘變(DpnI法)
1、引物設計：每條引物都要攜帶有所需的突變位點，引物一般長25~45bp,設計的突變位點需位于引物中部。2、反應：使用高保真的pyrobest DNA聚合酶 ;循環次數少，一般為12個循環。反應體系：10x pyrobest Buffer 5 uldNTP Mixture(10mM) 1ul模板DN
定點誘變(DpnI法)
1、引物設計：每條引物都要攜帶有所需的突變位點，引物一般長25~45bp,設計的突變位點需位于引物中部。2、反應：使用高保真的pyrobest DNA聚合酶 ;循環次數少，一般為12個循環。反應體系：10x pyrobest Buffer ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 5 uldN
定點誘變實驗
基本方案 利用PCR引物點突變 ? ? ? ? ? ? 實驗材料 DNA 試劑、試劑盒
定點誘變實驗
實驗材料 DNA試劑、試劑盒 TE寡核苷酸引物質粒dNTPDNA聚合酶氯仿石蠟油無水乙醇儀器、耗材 離心管熱循環儀離心機實驗步驟 1. ?利用突變區兩側的限制性內切酶位點將待誘變的DNA片段亞克隆進高拷貝數的載體中。?2. ?用小量制備的質粒提取模板DNA，用TE緩沖液重懸100 ng DNA至終濃
定點誘變實驗——基本方案
定點突變是指通過聚合酶鏈式反應（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因組，也可以是質粒）中引入所需變化（通常是表征有利方向的變化），包括堿基的添加、刪除、點突變等。定點突變能迅速、高效的提高DNA所表達的目的蛋白的性狀及表征，是基因研究工作中一種非常有用的手段。實驗材料DNA試劑、試劑盒TE寡核
關于基因定點誘變的概述
對于任何一種遺傳學研究，尤其是有關基因的結構與功能的分析，突變都是最基本的手段。經典的方法是，應用能夠修飾DNA分子的化學誘變劑或物理誘變劑處理生物體。此類誘變方法雖然已得到了廣泛的應用，獲得了大量的突變體，但亦存在著諸多的不便之處。 第一、經受誘變劑處理的生物體，它的任何基因都有可能發生突變
寡核苷酸定點誘變的概念
中文名稱寡核苷酸定點誘變英文名稱oligonucleotidedirected mutagenesis定 義人工獲得特定核酸定點突變的一種方案。將需要改變的核苷酸置于一段合成的寡核苷酸中部，在單鏈噬菌體(如M13)模板上用克列諾酶合成有指定變化的負鏈，再通過噬菌體復制得到含突變的雙鏈。應用學科生物
定點誘變實驗——利用PCR引物點突變
實驗材料DNA試劑、試劑盒DNA聚合酶klenow限制性內切酶儀器、耗材水浴鍋離心機培養箱實驗步驟1. ?制備模板（見基本方案，步驟1和2）?2. ?合成和純化寡核苷酸引物并對5‘端磷酸化。?3. ?擴增模板DNA（基本方案，步驟4和5），在最后一次延伸結束后，加5 U 的klenow酶，30℃保溫
定點誘變與盒式誘變的比較介紹
構建一個位點導向的文庫涉及使用含有一個或多個簡并密碼子的合成DNA片段替代一個基因片段。這可以通過雙鏈盒式誘變或單鏈寡核苷酸定向誘變來實現。我們相對傾向于寡核苷酸定向誘變，因為不同于盒式誘變，它不需要在目的區域附近有獨特的限制性酶切位點，并且構建一個文庫只需要一個寡核苷酸片段。因此，這個方法相當
分子遺傳學詞匯寡核苷酸定點誘變
中文名稱：寡核苷酸定點誘變英文名稱：oligonucleotide-directed mutagenesis定 義：用人工合成的寡核苷酸在特定位點導致突變。應用學科：遺傳學（一級學科），分子遺傳學（二級學科）
關于寡聚核苷酸的定點誘變技術介紹
是由加拿大的生物化學家M·史密斯（Michael Smith，1932—）發明的。其基本原理如下： 應用寡聚核苷酸進行DNA的定點誘變時，首先要把含有待突變的DNA片斷段克隆到MI3噬菌體載體中，MI3噬菌體的正鏈可以感染具有纖毛的細菌，并在細菌體內進行復制后，以出芽的形式形成新的帶有正鏈DN
寡聚核苷酸定點誘變技術的基本原理
寡聚核苷酸定點誘變技術是由加拿大的生物化學家M.史密斯（1932）發明的。其基本原理如下：應用寡聚核苷酸進行DNA的定點誘變時，首先要把含有待突變的DNA片段克隆到MI3噬菌體載體中，MI3噬菌體的正鏈可以感染具有纖毛的細菌，并在細菌體內進行復制后，以出芽的形式形成新的帶有正鏈DNA的噬菌體。而存留
DNA定點突變實驗
實驗方法原理?定點突變是指通過聚合酶鏈式反應（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因組，也可以是質粒）中引入所需變化（通常是表征有利方向的變化），包括堿基的添加、刪除、點突變等。單點突變的原理是從常規E.coli中經純化試劑盒(Miniprep)或者氯化銫純化抽提得到質粒。設計一對包含突變位點的
關于定點突變的單點突變的介紹
對于單點突變，Stratagene公司的QuikChange Site-directed Mutagenesis kit是不錯的選擇，通過巧妙設計，將質粒定點突變技術變得簡單有效。準備突變的質粒必須是從常規E.coli中經純化試劑盒(Miniprep)或者氯化銫純化抽提的質粒。設計一對包含突變位
利用大引物－PCR－在同一試管中進行高效快速定點誘變實驗
試劑、試劑盒 擴增緩沖液含有四種 dNTP 的混合溶液熱穩定 DNA 聚合酶瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠正向和反向內引物誘變引物模板 DNA儀器、耗材 帶屏障裝置的自動移液器用吸頭微型離心機用離心管可調式移液器實驗步驟 材料緩沖液和溶液貯存液，緩沖液和試劑的成分請參閱附錄 1。將貯存液稀釋到合適的濃度
利用大引物－PCR－在同一試管中進行高效快速定點誘變實驗
大引物方法最初是由 KAMMANN 等人（1989）建立的，現在的方法是經過許多研究人員包括 Sarkat 和 Sommer (1990,1992), Giebel 和 Spritz(1990)，Landt 等（1990),Marini 等（1993), Picard 等（1994),Ling 和
利用大引物－PCR－在同一試管中進行高效快速定點誘變實驗
? ? ? ? ? ? 試劑、試劑盒 擴增緩沖液 含有四種 dNTP 的混合溶液 熱穩定 DNA 聚合酶 瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠 正向和反向內引物 誘變引物
DNA定點突變實驗
DNA定點突變實驗 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 定點突變是指通過聚合酶鏈式反應（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因組，也可以是質粒）中引入所需變化（通常是表征有利方
DNA定點突變實驗
DNA定點突變可用于：（1）研究蛋白質相互作用位點的結構、改造酶的不同活性或者動力學特性；（2）改造啟動子或者DNA作用元件；（3）提高蛋白的抗原性或者是穩定性、活性、研究蛋白的晶體結構，以及藥物研發、基因治療等等方面。實驗方法原理定點突變是指通過聚合酶鏈式反應（PCR）等方法向目的DNA片段（可以
Sitedirected－Mutagenesis－using－PCR
Site-directed Mutagenesis using PCRMichael P. Weiner, Tim Gackstetter, Gina L. Costa, John C. Bauer, and Keith A. KretzFrom:?Molecular Biology: Curren
基因定點突變step－by－step
本文先講最簡單的一個點的定點突變技術，其它較長片段的突變，刪除，插入技術以后會慢慢奉上：?在做實驗之前，我們首先要搞清楚實驗的目的和實驗的原理。?實驗的目的應該比較明確吧：就是要把自己的基因上面的一個堿基換成另外一個堿基。一般情況下我們會有幾種可能使我們需要這樣去做：?第一 我們吊出來的基因有點突變
蛋白質工程提高穩定性的作用介紹
提高蛋白質的穩定性包括以下幾個方面： （1）延長酶的半壽期； （2）提高酶的熱穩定性； （3）延長藥用蛋白的保存期； （4）抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性喪失。 葡萄糖異構酶（GI）在工業上應用廣泛，為提高其熱穩定性，朱國萍等人在確定第138位甘氨酸(Gly138)為目標氨基酸后，用
盒式誘變的簡介
盒式誘變(cassette mutagenesis)是一種定點誘變技術，其方法是利用一段人工合成的具有突變序列的雙鏈寡核苷酸片段，取代野生型基因中相應序列。這種誘變的雙鏈寡核苷酸片段是由兩條人工合成的寡核苷酸鏈組成的，當它們退火時，會按照設計要求產生出克隆需要的粘性末端。這些合成的寡核苷酸片段就
基因定點突變step－by－step
本貼先講最簡單的一個點的定點突變技術，其它較長片段的突變，刪除，插入技術以后會慢慢奉上：在做實驗之前，我們首先要搞清楚實驗的目的和實驗的原理。實驗的目的應該比較明確吧：就是要把自己的基因上面的一個堿基換成另外一個堿基。一般情況下我們會有幾種可能使我們需要這樣去做：第一：我們吊出來的基因有點突變，相信
基因定點突變step－by－step
本貼先講最簡單的一個點的定點突變技術，其它較長片段的突變，刪除，插入技術以后會慢慢奉上：在做實驗之前，我們首先要搞清楚實驗的目的和實驗的原理。實驗的目的應該比較明確吧：就是要把自己的基因上面的一個堿基換成另外一個堿基。一般情況下我們會有幾種可能使我們需要這樣去做：第一：我們吊出來的基因有點突變，相信
用放射性標記的寡核苷酸雜交篩選定點誘變重組克隆實驗
實驗方法原理 試劑、試劑盒 甲酸銨寡核苷酸雜交溶液寡核苷酸預雜交液TE噬菌體T4多核苷酸激酶限制性內切核酸酶瓊脂糖凝膠誘變寡核苷酸[γ-32P]ATP2XYT 頂層瓊脂和 2xYT 瓊脂平皿儀器、耗材 鈍端鑷子皮下注射用針頭（18 號）和印度墨水孵箱硝酸纖維素膜或尼龍膜真空烤箱68°C 水浴What
用放射性標記的寡核苷酸雜交篩選定點誘變重組克隆實驗
本方案主要描述了篩選噬菌體 M13 重組克隆，而一種選擇方案是篩選含噬菌粒的細菌克隆。最后也介紹了用 PCR 檢測突變體的方法。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）下冊，作者：〔美〕J. 薩姆布魯克 D.W. 拉塞爾。實驗方法原理試劑、試劑盒甲酸銨寡核苷酸雜交溶液寡核苷酸預雜交液TE噬菌體T4多核
用放射性標記的寡核苷酸雜交篩選定點誘變重組克隆實驗
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 試劑、試劑盒 甲酸銨 寡核苷酸雜交溶液 寡核苷酸預雜交液 TE 噬菌體T4多核
定點突變技術——從單點突變到多點突變
?體外定點突變技術是研究蛋白質結構和功能之間的復雜關系的有力工具，也是我們在實驗室中改造/優化基因常用的手段。蛋白質的結構決定其功能，二者之間的關系是蛋白質組研究的重點之一。對某個已知基因的特定堿基進行定點改變、缺失或者插入，可以改變對應的氨基酸序列和蛋白質結構，對突變基因的表達產物進行研究有助于我
定點突變技術――從單點突變到多點突變
體外定點突變技術是研究蛋白質結構和功能之間的復雜關系的有力工具，也是我們在實驗室中改造/優化基因常用的手段。蛋白質的結構決定其功能，二者之間的關系是蛋白質組 研究的重點之一。對某個已知基因的特定堿基進行定點改變、缺失或者插入，可以改變對應的氨基酸序列和蛋白質結構，對突變基因的表達產物進行研究有助于我