AgilentSureSelectQXTWGS文庫制備的質量控制（二）
gDNA 的數量和完整性SureSelectQXT WGS 方案需要高質量的 DNA 樣品，以獲得最佳性能和 gDNA 起始材料的精確定量結果。按照該方案使用配有 dsDNA BR 分析試劑盒的 Qubit 儀器進行系列定量分析。將相同的樣品在 4200 TapeStation 系統和 NanoDrop 中均進行6次重復基因組 DNA ScreenTape 分析。圖2顯示了獲自 4200 TapeStation 系統、Qubit 和 NanoDrop 的數據，說明了基因組 DNA ScreenTape 分析法適用于對 gDNA 起始材料進行定量分析。采用UV 光譜法測定 gDNA 所得的量常會過高，這是由于其他緩沖液成分在 UV 光譜中也可能有吸收[4]。此外，基因組 DNA ScreenTape 分析法可在同一 QC 步驟中客觀評價樣品完整性。樣品完整性由 TapeStation 分析軟件的 DNA 完整......閱讀全文
液體處理專家如何自動化、標準化捕獲測序文庫制備
目標區域捕獲測序技術，是根據已知特定基因組區域序列設計寡核苷酸探針，通過雜交將目標區域捕獲富集進行二代測序。其針對目標區域深度測序，增加了檢查靈敏度和準確性。既滿足研究需求，又降低測序成本，在科研、臨床中均備受關注。液體處理專家貝克曼庫爾特推出Biomek 自動化捕獲測序方案，幫助您實現自動化、標準
基因組文庫和cDNA文庫的構建及篩選
劉芝華 中國醫學科學院腫瘤研究所??分子腫瘤學國家重點實驗室?概念：?基因組文庫是含有某種生物體全部基因的隨機片段的重組DNA克隆群體；cDNA文庫是指含有所有重組cDNA的克隆群體。???基因組文庫：來源于基因組DNA，反映基因組的全部信息，用于基因組物理圖譜的構建，基因組序列分析，基因在染色體上
用于基因組文庫的真核DNA的部分酶切（制備反應）實驗
通過限制酶部分酶切可將高分子質量 DNA 片段化。在預實驗中，建立了適宜的部分酶切條件。對于將用于克隆的基因組 DNA 來說，預實驗的結果確定了對其進行制備的三個大規模反應的條件，這將在本方案敘述。本實驗來源「分子克隆實驗指南第三版」黃培堂等譯。實驗方法原理通過限制酶部分酶切可將高分子質量 DNA
用于基因組文庫的真核DNA的部分酶切（制備反應）實驗
實驗方法原理 通過限制酶部分酶切可將高分子質量 DNA 片段化。在預實驗中，建立了適宜的部分酶切條件。對于將用于克隆的基因組 DNA 來說，預實驗的結果確定了對其進行制備的三個大規模反應的條件，這將在本方案敘述。實驗材料 限制性內切核酸酶基因組 DNAλ 噬菌體 DNA質粒寡聚體試劑、試劑盒 乙酸銨
用于基因組文庫的真核DNA的部分酶切（制備反應）實驗
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 通過限制酶部分酶切可將高分子質量 DNA 片段化。在預實驗中，建立了適宜的部分酶切條件。對于將用于克隆的基因組 DNA 來說，預實驗的結果確定了對其進行制備的三個大規模反應的條件，這將在本方案敘述。
cDNA－文庫的構建
此經典方案建立在 Gubler-Hoffman 法（Gulber-Hoffman 1983) 之上，分為六個階段。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）上冊，作者：黃培堂。實驗材料λ噬菌體臂大腸桿菌菌株用于λ噬菌體的包裝抽提物試劑、試劑盒放線菌素 D二硫蘇糖醇EDTATris-ClMgCl2反轉錄酶
cDNA－文庫的構建
? ? ? ? ? ? 實驗材料 λ噬菌體臂 大腸桿菌菌株 用于λ噬菌體的包裝抽提物 試劑、試劑盒 放線菌素 D
Fluidigm推出自動化文庫制備體系－可同時檢測53個基因突變
首個商業化的靶向NGS文庫制備方法上市啦。利用微流控技術，通過高效的NGS文庫制備工作流程，可同時檢測體細胞中53個實體瘤相關基因的突變。 Fluidigm公司近日推出了AdvantaTM Solid Tumor NGS Library Prep Assay，該方法根據目前腫瘤治療方法和已發表
cDNA－文庫的構建2
階段 3:cDNA 的甲基化 材料 緩沖液和溶液 將貯存液稀釋到合適濃度。 氯仿 10XEcoRⅠ 緩沖液 1XEcoRⅠ 甲基化酶緩沖液（選用) 如希望，可替代步驟 1 中的 Tris-HCl,NaCl 和 EDTA。 EDTA(0.5mol/L,pH8.0) 乙醇 MgCl2(
cDNA文庫的構建3
接頭-銜接子與cDNA的連接8.將下列試劑加入到已削成平末端的DNA中：10×T4噬菌體DNA聚合酶修復緩沖液 2μl800~1000 ng 的磷酸化接頭或銜接子 2μlT4噬菌體DNA連接酶（105 Weiss單位/ml） 1μl10 mmol/L ATP 2μl混勻后，在16℃溫育8~12h。9
cDNA文庫的物化方法
基因工程初始階段所用的方法，已不用。利用核酸雙螺旋之間存在著堿基G C，A T配對特性，分離目的基因。 例如：海膽rDNA分子內其G C含量可以達63%（其穩定性高，溶解溫度高），通過熱變性和S1酶解處理可得到提純50倍的rDNA，最后經氯化銫平衡梯度離心，得到相對分子量為1.9X107Dal
cDNA文庫的構建2
10. Sephadex G-50用含有10 mmol/L NaCl的TE(pH7.6)溶液進行平衡，然后通過離子柱層析將未摻入的dNTP和 cDNA分開。11. 加入0.1倍體積的3mol/L乙酸鈉（pH5.2）和2倍體積的乙醇，沉淀柱層析洗脫下來的cDNA，將樣品置于冰上至少15分鐘，然后在微量
cDNA文庫的構建1
分為六個階段：階段1：反轉錄酶催化合成cDNA第一鏈階段2：cDNA第二鏈的合成階段3：cDNA的甲基化階段4：接頭或銜接子的連接階段5：Sepharose CL-4B凝膠過濾法分離cDNA階段6：cDNA與λ噬菌體臂的連接 [階段1：反轉錄酶催化合成cDNA第一鏈] 1.在置于冰上的無菌微
YAC實驗——YAC文庫篩選
實驗步驟1. ?YAC中心實驗室用于篩選文庫的方法進展很快。2. ?將一塊或多塊微量滴定板微孔中的YAC克隆轉印到尼龍膜上，用單拷貝探針進行雜交，就可以篩選YAC文庫了。3. ?然而，由 于雜交實驗的信噪比較低以及制備所有的轉印尼龍膜所需的花費巨大，絕大多數實驗室已采用PCR方法來篩選文庫。4. ?
cDNA－文庫的構建3
階段 5:SepharseCL-4B 凝膠過濾法分離 cDNA材料緩沖液和溶液乙醇乙酸鈉（3 ml/L,pH5.2)TE(pH7.6)含 0.1mol/LNaCl 的 TE(pH7.6)Tris-HCl(1mol/L,pH8.0)凝膠瓊脂糖凝膠（1%)見步驟 8。核酸和寡核苷酸cDNA階段 4 中步
基因組文庫法
基因組文庫法一）基因組DNA分離、純化和加工[Mbo I酶檢測]1．準備1.5ml小試管4個；每管內含有：基因組DNA（在TE或水中）?????????????10.0μg10×Mbo I緩沖液?????????????????????????2.5μlH2O????????????????????
差減cDNA文庫法
差減cDNA文庫法[第一條鏈cDNA合成]1．合成第一條cDNA鏈時，所有試劑應按下列順序依次加入：10×第一條鏈合成緩沖液?????????????????5.0μl10mM dNTP Mix(1.4μg/μl)???????????????2.5μl(終濃度1.25mM)Linker prime
cDNA－文庫的構建（四）
方法cDNA 末端的削平1.cDNA樣品（來自步驟 11)于 68°C 加熱5 min。這一步驟是使cDNA分子的單鏈突出端可能形成的雙鏈結構發生變性。2. 將cDNA溶液冷卻至37°C并加入下列試劑：5xT4噬菌體DNA聚合酶修復緩沖液 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?
cDNA－文庫的構建（三）
階段 3:cDNA 的甲基化材料緩沖液和溶液將貯存液稀釋到合適濃度。氯仿10XEcoRⅠ 緩沖液1XEcoRⅠ 甲基化酶緩沖液（選用)如希望，可替代步驟 1 中的 Tris-HCl,NaCl 和 EDTA。EDTA(0.5mol/L,pH8.0)乙醇MgCl2(1mol/L)NaCl(5mol/L)
BAC/PAC－文庫的構建
BAC (Bacterial Artificial Chromosome，細菌人工染色體)文庫可用于：（1）全基因組測序；（2）構建物理圖譜、染色體步查；（3）基因篩選；（4）基因圖位克隆。實驗方法原理BAC是一種裝載DNA大片段的克隆載體系統，用于人、動物和植物基因組文庫構建。BAC具有插入片段較
文庫克隆載體介紹
用來構建所有這三種Ph.D.文庫的載體，M13KE，是可以購買到的。M13KE是M13mp19的衍生株，其pIII基因的5’端構建了限制性酶切位點，用戶可以將設計好的人工基因盒（synthetic cassette）插入此處構建自己的肽庫。因為M13KE是噬菌體，而不是噬菌粒載體，所以在已加
關于cDNA文庫的簡介
cDNA文庫（cDNA library）：是指某生物某一發育時期所轉錄的mRNA全部經反轉錄形成的cDNA片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。 cDNA文庫是以特定的組織或細胞mRNA為模板，逆轉錄形成的互補DNA（cDNA）與適當的載體（常用噬菌體或質粒載體）連接后轉化受體菌形成重組DNA
cDNA－文庫的構建（二）
7. 盡可能快地進行 cDNA 合成的下一步驟階段 2:cDNA 第二鏈的合成材料緩沖液和溶液將貯存液稀釋到合適濃度。氯仿EDTA(0.5mol/LpH8.0)乙醇MgCl2(1mol/L)(NH4)2SO4(1mol/L)將 1.3 g 固體硫酸銨溶解于終體積為 10 ml 的水中，溶液經濾膜過濾
BAC/PAC－文庫的構建
BAC文庫的構建 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 BAC是一種裝載DNA大片段的克隆載體系統，用于人、動物和植物基因組文庫構建。BAC具有插入片段較大(幾千個堿基至350kb)
cDNA－文庫的構建（一）
實驗材料 λ噬菌體臂大腸桿菌菌株用于λ噬菌體的包裝抽提物試劑、試劑盒 放線菌素 D二硫蘇糖醇EDTATris-ClMgCl2反轉錄酶RNase 抑制劑用于 cDNA 合成的寡核苷酸引物poly(A)+RNA[a-32P]dCTPEDTA乙醇(NH4)2SO4β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸T4
YAC實驗——YAC文庫構建
YAC帶有天然染色體所有的功能元件，包括一個著絲粒，一個DNA復制起點，兩個端粒。YAC能夠容納長達幾百kb的外源DNA，這是質粒和黏粒辦不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色體步移中每次允許更大的步移距離，同時能夠減少完整基因組文庫所需的克隆數目。實驗步驟1. ?盡管當插入片段大于10
差減cDNA文庫法2
[cDNA末端磷酸化]1.70℃滅活反應后，稍微離心一下，置室溫5分鐘。2.在反應混合物（10μl）中加入：1μl10×連接緩沖液2μl10mMATP1μl（10μ）DNA激酶 [限制性內切酶消化]以得到粘性末端 1.限制性內切酶消化DNA和載體。 2.在37℃保溫1~5小時，然后冷卻到
DNA文庫的構建及其篩選
DNA文庫的構建和篩選可以用于：（1）將某生物的全部基因組DNA用限制性內切酶或機械力量切割成一定長度的DNA片段，再與適合的載體在體外重組并轉化相應的宿主細胞獲得的所有陽性菌落。 （2）采用“化整為零”策略，將龐大的基因分解成一段段，每段包含一個或幾個基因。實驗方法原理高等植物基因組的一個顯著特征
DNA文庫的構建及其篩選
實驗材料?DNA試劑、試劑盒?升汞MS培養基瓊脂糖EcoR IHind IIIBamH IBg lII Pst I儀器、耗材?電泳儀尼龍膜實驗步驟 1.水稻 DNA 的提取水稻 DNA 的提取參照 Dellaporta, Wood 和 Hicks (1983) 法分離總基因組DNA并略有修改。 通過
噬菌體肽文庫的定義
中文名稱噬菌體肽文庫英文名稱phage peptide library定 義將編碼多肽的外源基因插入含噬菌體外殼蛋白基因的載體，構建得到能與外殼蛋白融合表達多肽的基因文庫。應用學科細胞生物學（一級學科），細胞生物學技術（二級學科）