從RNA的提取到PCR——RealtimePCR經驗
一 引物的設計引物的設計對于這個實驗至關重要，因為real time pcr的檢測靈敏度比較高，所以相應的對引物設計的要求就很高。普通的要求規則大家都知道，還有幾點必須注意：1，引物的錯配率（引物錯配形成引物二聚體，但是SYBR照樣能嵌入進去，結果導致實驗結果的誤差很大，重復性也不好）。2，引物的特異性一定要高（不像常規PCR，引物同源性不高，只要兩條產物的片段長度相差足夠大，在電泳的時候能夠區分開就可以。real time PCR只有在熔解曲線的時候能分開，所以這就造成整個實驗結果誤差很大，不可信）。3，引物設計要跨內含子，不能在一個外顯子上（我們的實驗是以cDNA為模板來擴增的，如果有DNA污染的話，因為DNA上含有分子量很大的內含子，不可能完成擴增。這對我們消除整個實驗的誤差起很大的作用）。4，引物設計的時候要盡可能設計在同一退火溫度，方便于以后同時擴增很多不同的基因片段。但是如果相差比較大，就得分開做，浪費模板，浪費管家......閱讀全文
從RNA的提取到PCR——Real-time PCR經驗
一 引物的設計引物的設計對于這個實驗至關重要，因為real time pcr的檢測靈敏度比較高，所以相應的對引物設計的要求就很高。普通的要求規則大家都知道，還有幾點必須注意：1，引物的錯配率（引物錯配形成引物二聚體，但是SYBR照樣能嵌入進去，結果導致實驗結果的誤差很大，重復性也不好）。2，引物的特
RNA抽提經驗
對大部分實驗人員來說，RNA 抽提比基因組 DNA 抽提要困難得多。事實上，現有的 RNA 抽提方法/試劑，如果用于從培養細胞中抽提 RNA，比抽提基因組 DNA 更方便，成功率也更高。那為什么同樣的方法用于組織 RNA 的抽提，總會碰到問題呢？ ??組織 RNA 抽提失敗的兩大現象是： RNA 降
Real-time PCR
實驗概要The ?exponential amplification via reverse transcription polymerase chain ?reaction provides for a highly sensitive technique in which a very low
Real-time PCR實驗心得和RNA提取心得
并不是所有的實驗都可以做real－time的，技術路線要選好當你的基因表達量少或有些不表達具體就是做普通pcr跑膠條帶比較弱，不是很亮的情況下個人覺得最好不要選擇real，不容易做好，特別是融解曲線用sbgr green染料做的話，引物設計時擴增片斷最好小于250bp，太長了不好擴預實驗先rt－pc
實時定量PCR（Real-time quantitative PCR）
mRNA表達的研究 微小殘留病變的檢測 腫瘤耐藥基因表達的研究 病毒感染的定量監測Vs普通PCR，RT-PCR的優勢 采用封閉的檢測模式，因此擴增產物導致污染的可能性比普通PCR要小得多 。 擴增產物的檢測在PCR擴增過程中同時進行，并且數據的采集、分析全部由 儀器 自動完成，因此整個檢測所 需的時
細胞RT-PCR的經驗(偏向RNA提取)
做RT也做了幾次,有成功也有失敗,在園子中受益良多,把我自已的一個流程放上來,供大家參考.細胞RT-PCR操作流程實驗流程一 、取RNA：1、 處理細胞：（1） 貼壁細胞：先用無菌DEPC水配制的PBS洗細胞兩次，棄盡PBS后，直接向培養瓶中加入1ml Trizol，通過溶解細胞，通過移液管分次移出
RT-PCR實驗方法大全(抽提RNA，RT，PCR)-3
4. 配制的溶液應盡可能的用0.1% DEPC，在37℃處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應當用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經 0.22μm濾膜過濾除菌。5. 操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實驗過程中手套要勤換。6. 設置RNA操作專用實驗室，所有器
RT-PCR實驗方法大全(抽提RNA，RT，PCR)-2
關于平臺期和線性期的問題，實際上線性期是指數期，只不過碰巧2的冥和2的倍數是相同的。看上去任何一個時期都可以，實際上是不對的，因為牽涉到酶促動力學的問題，這個我也不懂，有一些專門的文章，好像，涉及到很多化學的東西。我們學醫的，也沒必要知道那些，但是其中主要是因為模板引物酶原料和buffer之間的關系
RT-PCR實驗方法大全(抽提RNA，RT，PCR)-5
室溫下充分混勻，離心10000g×2min。取上層液置另一0.5 ml離心管中，加入100μl氯仿，混勻，離心10000g×2min。將上層液轉移至另一0.5ml 離心管中，再加入3M NaAc 10μl、預冷無水乙醇250μl，混勻后，-20OC靜置30min。4OC離心13500g×10
RT-PCR實驗方法大全(抽提RNA，RT，PCR)-6
可能問題出在標本的保存：一般四小時之內就應處理，分離出細胞說的是套式PCR,可以在你的第一次PCR兩個引物內,再設計一對引物進行第二次PCR就行了如果你的第一次PCR剛好包括目的片段,那只好設計個更長的了第二次的引物設計要求可以低一點以50μl體系為例引物各1μl第一次PCR產物5μl二次PCR和巢