RNA提取與RTPCR(3)
2.3 RT-PCR的引物設計 RT-PCR引物設計和一般PCR引物設計可以遵循同樣的原則。細心地進行引物設計是PCR中最重要的一步。理想的引物對只同目的序列兩側的單一序列而非其他序列退火。設計糟糕的引物可能會同擴增其他的非目的序列。設計理想的引物都有以下共同的特點，而設計失敗的引物則各有各的缺點： * 典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，并降低序列存在于非目的序列位點的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產量。 * 選擇GC含量為40％到60％或GC含量反映模板GC含量的引物。 * 設計5'端和中間區為G或C的引物。這會增加引物的穩定性和引物同目的序列雜交的穩定性。 * 避免引物對3'末端存在互補序列，這會形成引物二聚體，抑制擴增。 * 避免3'末端富含......閱讀全文
RNA提取與RT-PCR(3)
2.3 RT-PCR的引物設計 RT-PCR引物設計和一般PCR引物設計可以遵循同樣的原則。細心地進行引物設計是PCR中最重要的一步。理想的引物對只同目的序列兩側的單一序列而非其他序列退火。設計糟糕的引物可能會同擴增其他的非目的序列。設計理想的引物都有以下共同的特點，而設計失敗的引物則各有各的缺
RNA提取與RT-PCR
1．RNA的提取 RNA的提取其實原理很簡單：通過變性劑破碎細胞或者組織，然后經過氯仿等有機溶劑抽提RNA，再經過沉淀，洗滌，晾干，zui后溶解。但是由于RNA酶無處不在，隨時可能將RNA降解，所以實驗中有很多地方需要注意，稍有疏忽就會前功盡棄。 1．1分離高質量RNA 成功的cDNA合成來
RNA提取與RT-PCR(4)
2.8 小量RNA檢測方法的提高 當僅有小量RNA時，RT-PCR尤其具有挑戰性。在RNA分離過程中加入的作為載體的糖元有助于增加小量樣品的產量。可以在加入Trizol的同時加入無RNase的糖元。糖元是水溶性的，可以同RNA保持在水相中以輔助隨后的沉淀。對于小于50mg的組織或106個培養細胞
RNA提取與RT-PCR(1)
在做Northern等雜交實驗、構建cDNA文庫、獲取能夠編碼真核生物蛋白的基因、獲得RNA病毒基因時，會用到RNA提取和RT-PCR技術。 真核生物的基因組是DNA，為什么不直接從DNA PCR得到我們需要的基因呢？因為真核生物的基因含有大量的非編碼區，稱為內元（intron），真正編碼蛋
RNA提取與RT-PCR(2)
融解RNA一般使用TE。 保存RNA應該盡量低溫。為了防止痕量RNase的污染，從富含RNase的樣品（如胰臟、肝臟）中分離到的 RNA需要貯存在甲醛中以保存高質量的RNA，對于長期貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的RNA，在水中貯存一個星期就基本降解了，而從大鼠脾臟中提取的 RNA，在水
RT－PCR技術及RNA提取策略-3
成功的RT PCR的要素1、高質量RNA 成功的cDNA合成來自高質量的RNA。高質量的RNA至少應保證全長并且不含逆轉錄酶的抑制劑，如EDTA或SDS。RNA的質量決定了你能夠轉錄到 cDNA上的序列信息量的最大值。一般不必使用oligo（dT）選擇性分離poly（A）+RNA。不管起始模
RNA提取和RT-PCR
真核生物的基因組是DNA，為什么不直接從DNA?PCR得到我們需要的基因呢？因為真核生物的基因含有大量的非編碼區，稱為內元（intron），真正編碼蛋白的區段是被這些內元隔開的，這些編碼區叫做外元（exon）。真核生物的DNA轉錄成為RNA之后，經過剪切和拼接，去掉這些非編碼區，才形成成熟的mRNA
RNA提取和RT-PCR
在做Northern等雜交實驗、構建cDNA文庫、獲取能夠編碼真核生物蛋白的基因、獲得RNA病毒基因時，會用到RNA提取和RT-PCR技術。真核生物的基因組是DNA，為什么不直接從DNA PCR得到我們需要的基因呢？因為真核生物的基因含有大量的非編碼區，稱為內元（intron），真正編碼蛋白的區段是
總RNA提取與Northern雜交（3）
第二天：將上述物品揭開，將膠正面朝下，膜正面朝上，用鉛筆作好標記。將膠浸泡在EB中1-2分鐘，用DEPC H2O清洗，將膜放在濾紙上面，夾好，4度下保存，或者直接進行預雜交。UV雜交（有助于RNA結合到膜上面）。五、預雜交和雜交預雜交和雜交 buffer： 100ul20×SSC 25ml （5×S
RNA 提取策略及RT－PCR技術
第一部分RNA 提取策略1、RNA降解的原因內源性RNAase是造成RNA降解的最重要原因，因為人體細胞自身就是幾十分鐘（20min？）mRNA被降解一輪，所以不管是組織還是細胞還是液體狀樣本在離開其中細胞的最佳生活狀態后都應該盡快的被妥善的方法保存起來。外源性RNA酶也是一個需要注意的因素，最常見