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(一)抗體要求將熒光素與特異性抗體以化學共價鍵的方式結合而成。一般需經純化提取IgG后再作標記。(二)熒光素要求 異硫氰酸熒光素最常用要求：①應具有能與蛋白質分子形成共價鍵的化學基團，與蛋白質結合后不易解離，而未結合的色素及其降解產物易于清除；②熒光效率高，與蛋白質結合后，仍能保持較高的熒光效率；③熒光色澤與背景組織的色澤對比鮮明；④與蛋白質結合后不影響蛋白質原有的生化與免疫性質；⑤標記方法簡單、安全無毒；⑥與蛋白質的結合物穩定，易于保存。(三)抗體的熒光素標記1.攪拌法：適用于標記體積較大、蛋白含量較高的抗體溶液。優點是標記時間短、熒光素用量少。但易引起較強的非特異性熒光染色。2.透析法：適用于標記樣品量少、蛋白含量低的抗體溶液。此法標記比較均勻，非特異染色也較低。(四)熒光素標記抗體的純化抗體標記完成后，還應對標記抗體作進一步純化，以去除未結合的游離的熒光素。純化方法可采用透析法或層析分離法。(五)熒光抗體的鑒定1.熒光素與......閱讀全文
免疫熒光細胞化學技術免疫熒光細胞化學是現代生物學和醫學中廣泛應用的技術之一，是由Coons等（1950）建立，經過近43年的發展，免疫熒光技術與形態學技術相結合發展成免疫熒光細胞（或組織）化學。它與親合化學技術如葡萄球菌A蛋白（SPA）、生物素與卵白素、植物血凝素（ConA等）相結合拓寬了領域；與激
免疫熒光組織化學是根據抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素，再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢查細胞或組織內的相應抗原(或抗體)。在細胞或組織中形成的抗原抗體復合物上含有標記的熒光素，熒光素受激發光的照射，由低能態進入高能態，而高能態的電子是不穩定的，以輻射光量子的形式釋放能量后，
實驗材料細胞小玻片標本試劑、試劑盒熒光抗體實驗步驟熒光抗體染色按不同反應機制，可有以下幾種：1.直接法 用已知特異性病毒抗體與熒光素結合，制成熒光特異性抗體，直接與細胞或組織中相應病毒抗原結合，在熒光顯微鏡下即可見病毒或病毒抗原存在部位呈現特異性熒光。此法特異簡便，但一種熒光抗體只能檢查一種抗原，特
流式細胞術工作原理是在細胞分子水平上通過單克隆抗體對單個細胞或其他生物粒子進行多參數、快速的定量分析。它可以高速分析上萬個細胞，并能同時從一個細胞中測得多個參數，具有速度快、精度高、準確性好的優點，是當代最先進的細胞定量分析技術之一。光源、液流通路、信號檢測傳輸和數據的分析系統是流式細胞儀的主要組成
免疫熒光細胞化學染色方法 一、標本制作 可制作涂片、印片、細胞單層培養物、組織切片，經適當固定或不固定，作免疫熒光染色用。 二、熒光抗體染色方法 （一）直接法 1．染色 切片經固定后，滴加經稀釋至染色效價如1：8或1：16的熒光抗體（如兔抗人γ-球蛋白熒光 抗體或兔抗人 IgG 或 IgA 熒光抗體
四、熒光抗體的保存 以0～4℃或-20℃低溫保存，防止抗體活性降低和蛋白變性。最好加入濃度為1：5000～10000的硫柳汞或1：1000～5000的疊氮鈉防腐，小量分裝如0.1～1ml，真空干燥后更易長期保存。[NextPage] 第三節 免疫熒光細胞化學染色方法 一、標本制作 可制作涂片
一、標本制作 可制作涂片、印片、細胞單層培養物、組織切片，經適當固定或不固定，作免疫熒光染色用。 二、熒光抗體染色方法 （一）直接法 1．染色 切片經固定后，滴加經稀釋至染色效價如1：8或1：16的熒光抗體（如兔抗人γ-球蛋白熒光抗體或兔抗人IgG或IgA熒光抗體等），在室溫或37℃染色30
一、非特異性染色的主要因素 組織的非特異性染色的機理很復雜，其產生的原因主要可分為以下幾點： （1）一部分熒光素未與蛋白質結合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。 （2）抗體以外的血清蛋白與熒光素結合形成熒光素脲蛋白，可與組織成分結合。 （3）除去檢查的抗原以外，組織中還可能存在類屬抗
一、非特異性染色的主要因素 組織的非特異性染色的機理很復雜，其產生的原因主要可分為以下幾點： （1）一部分熒光素未與蛋白質結合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。 （2）抗體以外的血清蛋白與熒光素結合形成熒光素脲蛋白，可與組織成分結合。 （3）除去檢查的
免疫熒光組織（細胞）化學染色方法：直接法基本原理 將熒光素標記在相應的抗體上，直接與相應抗原反應。其優點是方法簡便、特異性高，非特異性熒光染色少。缺點是敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。此法常用于細菌、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢、皮膚活檢的免疫病理檢查。 試劑與儀器 磷酸鹽
四、熒光圖像的記錄方法 熒光顯微鏡所看到的熒光圖像，一是具有形態學特征，二是具有熒光的顏色和亮度，在判斷結果時，必須將二者結合起來綜合判斷。結果記錄根據主觀指標，即憑工作者目力觀察。作為一般定性觀察，基本上可靠的。隨著技術科學的發展，在不同程度上采用客觀指標記錄判斷結果，如用細胞分光光度計，圖像
1、產生非特異性染色的主要因素（1）一部分熒光素未與蛋白質結合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。（2）抗體以外的血清蛋白與熒光素結合形成熒光素脲蛋白，可與組織成分結合。（3）除去檢查的抗原以外，組織中還可能存在類屬抗原（如Forssman氏抗原），可與組織中特異性抗原以外之之相應抗體結合。（
免疫熒光組織（細胞）化學染色方法：直接法基本原理 將熒光素標記在相應的抗體上，直接與相應抗原反應。其優點是方法簡便、特異性高，非特異性熒光染色少。缺點是敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。此法常用于細菌、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢、皮膚活檢的免疫病理檢查。
一、非特異性染色的主要因素 組織的非特異性染色的機理很復雜，其產生的原因主要可分為以下幾點： （1）一部分熒光素未與蛋白質結合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去 。 （2）抗體以外的血清蛋白與熒光素結合形成熒光素脲蛋白，可與組織成分結合。 （3
一、免疫標記法及其分類1.熒光免疫法原理是應用一對單克隆抗體的夾心法。底物用磷酸-4-甲基傘形酮，檢測產物發出的熒光，熒光強度與Mb濃度呈正比，可在8min內得出結果。結果以 Mb每小時釋放的速率表示(△Mb)表示。該法重復性好，線性范圍寬，具有快速、敏感、準確的特點。以雙抗夾心法為例，首先將特異性
一、免疫標記法及其分類1.熒光免疫法原理是應用一對單克隆抗體的夾心法。底物用磷酸-4-甲基傘形酮，檢測產物發出的熒光，熒光強度與Mb濃度呈正比，可在8min內得出結果。結果以Mb每小時釋放的速率表示(△Mb)表示。該法重復性好，線性范圍寬，具有快速、敏感、準確的特點。以雙抗夾心法為例，首先將特異性抗
外周血是臨床檢驗中的重要標本。FCM分析外周白細胞的主要目的是了解各種白細胞的數目與分群情況。這些數字的變化與臨床的某些疾病有一定的關系。近年來，由于多種識別白細胞膜表面抗原的單克隆抗體的發現，以及對這些單克隆抗體的直接或間接熒光標記物的出現，使得利用FCM的熒光組織化學分析獲得被測細胞的多指標的更
外周血是臨床檢驗中的重要標本。FCM分析外周白細胞的主要目的是了解各種白細胞的數目與分群情況。這些數字的變化與臨床的某些疾病有一定的關系。近年來，由于多種識別白細胞膜表面抗原的單克隆抗體的發現，以及對這些單克隆抗體的直接或間接熒光標記物的出現，使得利用FCM的熒光組織化學分析獲得被測細胞的多指標的更
一、免疫標記法及其分類1.熒光免疫法原理是應用一對單克隆抗體的夾心法。底物用磷酸-4-甲基傘形酮，檢測產物發出的熒光，熒光強度與Mb濃度呈正比，可在8min內得出結果。結果以Mb每小時釋放的速率表示(△Mb)表示。該法重復性好，線性范圍寬，具有快速、敏感、準確的特點。以雙抗夾心法為例，首先將特異性抗
免疫熒光技術(immunofluorescence technique)是一種以熒光物作為標記物的免疫分析技術，熒光物質分子在特定條件下吸收激發光的能量后，分子呈激發態而極不穩定，其迅速回到基態時，可以電磁輻射形式釋放出所有的光能，發射出波長較照射光長的熒光。用熒光素與已知的抗體（或抗原，較少用
一)免疫熒光組織化學原理 將已知抗原或抗體標記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢查細胞或組織內的相應抗原(或抗體)。在細胞或組織中形成的抗原抗體復合物上含有標記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受到激發光的照射會發出明亮的熒光(黃綠色或橘紅色
一、 實驗準備1． 標本制備：2． zui小化非特異性結合： 二、凋亡1．凋亡的檢測方法：網站和其它2．PI染色法3．Annexin V 法4．TUNNEL法 三、細胞因子1．激活的細胞因子2．CBA 四、血小板
免疫熒光技術（Immunofluorescence technique）又稱熒光抗體技術，根據抗原抗體反應的原理，將熒光素偶聯到已知的抗原或抗體上制成熒光探針，與血清或體液、細胞、組織中存在的相應抗體（或抗原）結合，從而對這些組織中存在的抗原或抗體進行定性、定量和（或）定位的檢測。抗體的選擇
免疫熒光技術是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。它是根據抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光基團，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢查細胞或組織內的相應抗原（或抗體）。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質和定位，以及
免疫熒光細胞化學方法的原理是根據抗原抗體反應的規律，把已知的抗原或抗體標記上熒光素，制成熒光抗原或抗體，然后以它作為探針來檢測組織或細胞內的相應物質。方法具體種類有直接法、間接法、夾心法和補體法等。在熒光顯微鏡下，根據其形成復合物所發的熒光，來確定判斷檢測物的來源、性質和部位。 1、直接法
一、標本制作可制作涂片、印片、細胞單層培養物、組織切片，經適當固定或不固定，作免疫熒光染色用。 二、熒光抗體染色方法 （一）直接法 1．染色 切片經固定后，滴加經稀釋至染色效價如1：8或1：16的熒光抗體（如兔抗人γ-球蛋白熒光抗體或兔抗人IgG或IgA熒光抗體等），
1.直接染色法將標記的特異熒光抗體直接加在抗原標本上，經一定溫度和時間的染色，洗去未參加反應的多余熒光抗體，在熒光顯微鏡下便可見到被檢抗原與熒光抗體形成的特異性結合物而發出的熒光。直接染色法的優點是：特異性高，操作簡便，比較快速。缺點是：一種標記抗體只能檢查一種抗原，敏感性較差。直接法應設陰、陽性標
1、染色過強 原因 解決辦法抗體的濃度過高或抗體孵育時間過長 降低抗體滴度（一般指濃縮性抗體）抗體 孵育時間：室溫1小時或4℃過夜 孵育溫度過高，孵育溫度超過37℃ 一般室溫20-28℃ DAB顯色時間過長或DAB濃度過高 顯色時間不能超過5-10分鐘，以顯微鏡下 觀察
1、染色特異性和敏感性的測定方法 （1）特異性染色和效價測定 直接染色法中效價以倍比稀釋如1：2、1：4、1：8……，與相應抗原標本作一系列染色，熒光強度在“+++”的最大稀釋度，為其染色滴度（效價）或單位。實際染色時，可取低一個或兩個稀釋度（即2~4個單位），如染色效價為1：6
（二）透析法熒光素如FITC分子可以通過半透膜，而蛋白質大分子不能透過，可將未與蛋白結合的熒光素透析除去。（1）將標記完畢的熒光蛋白液裝入一透析袋或玻璃紙袋內，液面稍留空隙，緊扎。（2）浸入0.02mol/pH。7.1~7.4的PBS中（懸于大于標記物體積約50~100倍的PBS內），在4℃中透析，