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westernblot中分離膠濃度的選擇取決于目的蛋白分子量不同的分離膠濃度對不同的目的蛋白分子量的分辨率不一樣，比如15%的分離膠更適合45kDa的分目的蛋白，而10%的分離膠更適合70kDa的目的蛋白而因為westernblot的膜應該是完全覆蓋SDSPAGE的凝膠，所以不用太擔心條帶在凝膠上位置偏上活偏下所以westernblot中分離膠濃度的選擇取決于目的蛋白分子量如果以溴酚藍跑到膠的底部為準,26kD在10%的由下往上1/4的地方,而15%就在由下往上大約1/2（不太確定）的地方,對于分子量比較小的蛋白,當然是膠的濃度越大,分離效果越好.但是你必須考慮到,膠的孔徑一旦小于蛋白-SDS復合體的直徑,分子量大于這個蛋白的所有蛋白仍然不能有好的分離效果.如果孔徑太大,所有蛋白都跑得那么快,也是分不開的.所以,關鍵是看這個分子量附近的蛋白,比如±5kD以內的所有蛋白,在不同濃度的膠中的速度差要盡可能達到最大,假設是對數正態分布......閱讀全文
56) 向您請教一個問題，我用pET28載體、宿主菌BL21(DE3)表達目的蛋白，目的蛋白的兩端都帶His-tag,蛋白的大小為37kD，在利用Ni-NTA純化時總是在目的蛋白帶旁邊伴隨一條帶去除不了，請問有什么高招可以解決這個問題？!!!此外，該表達產物為包涵體，請問這種產物可不可以直接用來制備
Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產物，可通過融合部分的抗體檢測。 本文主要通過以下幾個方面來詳細地介紹一下Western Blot技術: 一、原理 二、分類
Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產物，可通過融合部分的抗體檢測。一、原理與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被
蛋白純化經驗指南生物谷整理 http://www.bioon.com 原創：Chromatography weixingui@263.net， 推薦書籍：《蛋白純化與實驗鑒定指南》、《生物工程下游技術》、《酶工程》、《酶制劑工業》 1) 我現在手頭
1. 跑page膠的時候 小電壓跑會避免高電壓產生的熱量爾導致的膠層變形。低電壓泳道會比大電壓泳道跑的直一些，且分離效果更高，有利于分子量相差不大的蛋白分離。 2. 提取質粒的時候 最后一步的酒精揮發很關鍵，基本上是其后續的酶切反應的決定性因素。所以這一步盡量揮發長一點時間，最好是空調吹熱
一．蛋白樣品制備 之前和大家介紹過細胞和組織蛋白質的提取，當我們做WB的時候，需要對提取好的蛋白樣品進行處理：在蛋白樣品中加入SDS loading buffer 6X（蛋白上樣緩沖液）稀釋至1X（如蛋白樣品有120ul，則加入SDS loading buffer 6X 600ul），混勻，7
關于包涵體的純化是一個令人頭疼的問題，包涵體的復性已經成為生物制藥的瓶頸，關于包涵體的處理一般包括這么幾步：菌體的破碎、包涵體的洗滌、溶解、復性以及純化，內容比較龐雜 一、菌體的裂解 1、怎樣裂解細菌？ 細胞的破碎方法 1.高速組織搗碎
關于包涵體的純化是一個令人頭疼的問題，包涵體的復性已經成為生物制藥的瓶頸，關于包涵體的處理一般包括這么幾步：菌體的破碎、包涵體的洗滌、溶解、復性以及純化，內容比較龐雜 一、菌體的裂解 1、怎樣裂解細菌？ 細胞的破碎方法 1.高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放
9. 條件的摸索DDD. 用的是Santa Cruz的抗體，也實驗過一抗和二抗肯定能結合，二抗加DAB肯定能顯色。電泳的膠用考馬斯亮藍染色沒問題，但是不知道與Marker對應的條帶是否是我要的（我目的蛋白的分子量分別是55KD、29KD）。半干法2小時轉膜后，麗春紅染色發現大分子量蛋白轉過去的較少。
相關專題 蛋白Marker可分為：一、未預染的Marker即寬分子 量蛋白標準、高分子量蛋白標準以及低分子量蛋白標準;二、預染的Marker即單色預染和多色預染。在western blot 過程中，分子量Marker就像個螺絲釘一樣沒雖然是個小細節，然而就是這樣一個小細節對實驗結果有著
蛋白提取：１． 總蛋白提取（胞膜，胞漿，胞核）： 組織勻漿后,15000g, 4度, 20分鐘后,取上清.Buffer:NP40 750ul, 脫氧膽酸鈉0.5克, SDS 0.1克, 加1*PBS 至100ml. 再加入PMSF(7.4mg/ml) 0.1ml. (
estern Blot（WB）可以說是生物學方向的同學最...最基本的實驗技能了，然而好看的 WB 總是別人的，自己的 WB 總是雜帶叢生，尤其是新課題、新抗體，總在目的條帶附近出現非特異性條帶。產生這種狀況的原因是什么呢、用下面的幾個例子，咱們一起研究一下。 案例一：啥也
瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA時,跑出的帶后面出現拖尾現象,什么原因造成的?參考見解： DNA帶模糊：1、 DNA降解??避免核酸酶污染。2、 DNA上樣量過多??減少凝膠中DNA上樣量。3、 所用電泳條件不合適??電泳時電壓不應超過20V/cm，溫度＜30℃,巨大DNA鏈，溫度應＜15℃，核查所用電泳緩
estern Blot（WB）可以說是生物學方向的同學最...最基本的實驗技能了，然而好看的 WB 總是別人的，自己的 WB 總是雜帶叢生，尤其是新課題、新抗體，總在目的條帶附近出現非特異性條帶。產生這種狀況的原因是什么呢、用下面的幾個例子，咱們一起研究一下。 案例一：啥也沒有 原因：比較多
estern Blot（WB）可以說是生物學方向的同學最...最基本的實驗技能了，然而好看的 WB 總是別人的，自己的 WB 總是雜帶叢生，尤其是新課題、新抗體，總在目的條帶附近出現非特異性條帶。產生這種狀況的原因是什么呢、用下面的幾個例子，咱們一起研究一下。 案例一：啥也沒有 原因：比較多
要跑瓊脂糖凝膠電泳， 5ng 就能很清楚的跑出來是這樣嗎？能夠照相的清楚的條帶，至少需要多少量呢？ 參考見解：5ng 已經可以了，但是或許20ng50ng-200ng效果好，在此范圍內呈線性。 把210bp的pcr產物進行酶切,得到190+20bp的兩個片段,請問能用瓊脂糖凝
要跑瓊脂糖凝膠電泳， 5ng 就能很清楚的跑出來是這樣嗎？能夠照相的清楚的條帶，至少需要多少量呢？參考見解：5ng 已經可以了，但是或許20ng50ng-200ng效果好，在此范圍內呈線性。把210bp的pcr產物進行酶切,得到190+20bp的兩個片段,請問能用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果嗎?用多大
瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質的一種電泳方法。其分析原理與其他支持物電泳的最主要區別是：它兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。 瓊脂糖凝膠具有網絡結構，物質分子通過時會受到阻力，大分子物質在涌動時受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質和數量，而且還取決于分子大小，
瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質的一種電泳方法。其分析原理與其他支持物電泳的最主要區別是：它兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。 瓊脂糖凝膠具有網絡結構，物質分子通過時會受到阻力，大分子物質在涌動時受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質和數量，而且還取決于分子大小，
雙向電泳IEF （sigma）IEF（not IPG）/SDS-PAGE最簡單的裝備推薦如下,適合于沒多少money做IPG又想做“熱”的所謂蛋白質組的. IEF用Biorad的圓盤電泳槽（不行用國產的吧,不推薦）,SDS-PAGE用六
1、要跑瓊脂糖凝膠電泳，5ng就能很清楚的跑出來，是這樣嗎？能夠照相的清楚的條帶，至少需要多少量呢？ 參考見解 ： 5ng已經可以了，但是或許20ng～200ng效果好，在此范圍內呈線性。 2、把210bp的PCR產物進行酶切，
DNA瓊脂糖凝膠電泳 實驗方法原理 利用DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時具有的電荷效應和分子篩效應。
電泳法 實驗方法原理 DNA瓊脂糖凝膠電泳的基本原理是利用DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時具有的電荷
實驗原理： WesternBlot印跡方法，又稱為免疫印記，是將獲得的蛋白質樣品通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，對不同分子量的蛋白質進行分離，并通過轉移電泳將凝膠上分離到的蛋白質轉印至固相支持物（NC膜或PVDF膜）上，用抗靶蛋白的非標記抗體（一抗）與轉印后膜上的靶蛋白進行特異性結合，再與
EEE. 電泳用的是恒流，一塊膠，20mA，100分鐘左右。轉膜也是恒流，38mA，100分鐘。而且我用別人的細胞和一抗在我的整個反應體系下做出來了，當然彼此的目的蛋白不同。所以，我想問題應該出在抗原和一抗上，不知對不對。 解答：電泳的條件：樣品的分子量決定了膠的濃度，一般使樣品跑至膠的中部即可
這兩年在美帝凈做克隆實驗了，以前讀PHD時候還覺得自己分子克隆挺牛X的，來這邊之后做了各種各樣的構建才知道以前是坐井觀天，剛才粗粗統計了一下，在美帝一年零八個月，我構建的質粒的超過四百個，其中有很簡單從PCR構建到拿WB結果的一共不到一周，也有巨難的花了四個月時間換了幾次strategy才弄好激動得
這兩年在美帝凈做克隆實驗了，以前讀PHD時候還覺得自己分子克隆挺牛X的，來這邊之后做了各種各樣的構建才知道以前是坐井觀天，剛才粗粗統計了一下，在美帝一年零八個月，我構建的質粒的超過四百個，其中有很簡單從PCR構建到拿WB結果的一共不到一周，也有巨難的花了四個月時間換了幾次strategy才弄好激動得
DNA電泳可用于：（1）分離不同大小的DNA片段；（2）鑒定目的DNA片段；（3）純化和回收DNA片段。實驗方法原理DNA瓊脂糖凝膠電泳的基本原理是利用DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時具有的電荷效應和分子篩效應。電荷效應是指DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負電，在電場中向正極移動，且相同數量的雙鏈
DNA電泳可用于：（1）分離不同大小的DNA片段；（2）鑒定目的DNA片段；（3）純化和回收DNA片段。實驗方法原理利用DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時具有的電荷效應和分子篩效應。電荷效應是指DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負電，在電場中向正極移動，且相同數量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，能以
最近在做原核表達，包涵體。以前也做過，但經驗不多。一點失敗的教訓以及純化過程中的體會，貼出來與大家共享，同時希望得到同行們的指正1. 首先介紹一下背景。載體是invitrogen公司的pET22b，Amp抗性。菌株是該公司的BL21 star DE3，是一個蛋白降解酶突變菌株，也就是說是一種優化表達