為什么質粒酵母電轉化不進去
釀酒酵母的電轉感受態制備方法和電轉化方法(1)接種工業酒精酵母至30 mL液體YEPD培養基，30度培養12 h；(2)取培養物以1%的接種量轉接到30 mL新鮮YEPD液體培養基中，30度培養8 h，使菌體達到同步生長狀態；(3)將酵母培養物置于冰上放置30 min后，6,000 r/min離心5 min收集菌體；(4)棄上清，加入已預冷的15 mL超純水洗滌菌體一次；(5)6,000 r/min離心5 min收集菌體，用15 mL 1 mol/L山梨醇重復洗滌菌體三次；(6)離心收集菌體，加入200μL 1 mol/L山梨醇重懸浮菌體，取200μL的菌懸液至1.5 mL離心管中；(7)在制得的菌懸液中加入20μL(≤5μg)待轉化的質粒或DNA片段，輕輕混勻后冰浴10 min；(8)將冰浴后的菌懸液轉入已預冷的電轉杯中，1,500 V電擊5 ms；(9)加入適量體積的1 mol/L山梨醇將電轉后的菌懸液從電轉杯中洗出，取20......閱讀全文
為什么質粒酵母電轉化不進去
釀酒酵母的電轉感受態制備方法和電轉化方法(1)接種工業酒精酵母至30 mL液體YEPD培養基，30度培養12 h；(2)取培養物以1%的接種量轉接到30 mL新鮮YEPD液體培養基中，30度培養8 h，使菌體達到同步生長狀態；(3)將酵母培養物置于冰上放置30 min后，6,000 r/min離心5
畢赤酵母電轉化
實驗概要本實驗介紹了畢赤酵母電轉化方法。該方法無需產生去壁細胞，是產生畢赤酵母重組子的簡便方法。與去壁細胞效率相似。實驗步驟1. 細胞準備：?? 1) 在含5mlYPD 的50ml 離心管中，培養畢赤酵母，30 度過夜。?? 2) 取0.1-0.5ml 過夜培養物，接種含500ml 新鮮培養基的2L
重組質粒的電轉化法
首先，將0.1cm的電擊杯放在冰上進行預冷，凍存的感受態細胞取出冰上溶解。2然后，用100微升的感受態細胞加入1微升純化的連接液，或者加入0.5微升未純化的連接液，小心混勻，在冰上放置二十分鐘。3然后，將混合液加入預冷的電擊杯中，注意擦干杯外的水，防止電火花，放入電轉化儀的反應槽內，接上電源。4然后
質粒太大轉染轉不進去怎么辦
更換質粒、優化轉化條件、使用不同類型的轉化方法、檢查菌種狀態。1、更換質粒。質粒本身太大的問題導致轉不進去，可以嘗試更換另一種質粒，以確保其質量和兼容性。2、優化轉化條件。轉化條件如質粒濃度、農桿菌菌液濃度、轉化時間、轉化溫度等，都可能影響轉化效果。可以嘗試調整這些條件，以優化轉化過程。3、使用不同
質粒DNA導入細菌細胞實驗——電轉化法
實驗方法原理高壓電轉化簡單，快捷可靠，而且是目前效率最高的質粒DNA轉化大腸桿菌方法。不過該方法需要電轉化裝置。實驗材料菌落試劑、試劑盒LB甘油SOC儀器、耗材平板離心瓶聚丙烯管電阻器電轉化池實驗步驟1. ?接種一個單菌落于5 ml LB培養液，37°C溫和振搖培養5 h或過夜。2. ?將2.5 m
質粒的酵母直接轉化
1．用牙簽從平板中挑取單菌落（直徑2～3mm），轉移到1.5ml的無菌離心管中。2．將10μl載體DNA（100μg）與10μl轉化質粒DNA混合，振蕩均勻。（若轉化DNA是用未經RNA酶處理的“mini－prep DNA”方法制得，則不需加載體DNA）。3．加0.5ml PLATE溶液，振蕩。PL
質粒的酵母直接轉化
實驗方法原理將待測基因與Gal4或LexA或其他合適蛋白的DNA結合域融合構建誘餌質粒；將誘餌質粒轉化缺乏報告基因啟動子的酵母細胞株中，選擇被轉化的酵母；再將文庫質粒轉化到酵母中實驗材料單菌落試劑、試劑盒PLATE溶液載體DNA轉化質粒DNA儀器、耗材離心管離心機實驗步驟1、 用牙簽從平板中挑取單菌
酵母質粒載體的特點
酵母質粒載體既可以在大腸桿菌復制與擴增、又可以在酵母系統中復制與擴增，故此類載體又稱為穿梭載體(shuttlevector)。在基因工程中，應用上述病毒表達載體在哺乳動物細胞中進行中、小規模的表達是十分實際的。還要有對組織培養技術十分熟悉的前提。但病毒載體的運用仍然存在技術較難、耗時間和不經濟的問題
酵母質粒載體的特點
酵母質粒載體既可以在大腸桿菌復制與擴增、又可以在酵母系統中復制與擴增,故此類載體又稱為穿梭載體(shuttlevector)。 在基因工程中,應用上述病毒表達載體在哺乳動物細胞中進行中、小規模的表達是十分實際的。還要有對組織培養技術十分熟悉的前提。但病毒載體的運用仍然存在技術較難、耗時間和不經
酵母細胞中質粒的加工實驗——從酵母細胞中分離質粒
利用一個假定的突變通過互補作用克隆酵母菌基因的一般方法。該突變為cdc101-1，它對酵母菌的生長來說既是隱性的又是溫度敏感的。它使酵母可以很正常地在30°C生長，而不能在37°C形成菌落。如果用一個酵母菌基因組文庫轉化cdc101-1菌株，通過分離溫度不敏感菌落，那么就可能分離到一個可以互補這種突
酵母細胞中質粒的加工實驗_穿梭質粒
實驗材料帶有一個非URA3選擇標記YCp載體試劑、試劑盒缺失成分平板+Ura含有5-FOAYCp質粒選擇性培養基的平板YPD平板YIP5載體儀器、耗材培養皿實驗步驟1) 構建染色體上重要基因被破壞的單倍體菌株以及含有完整重要基因和URA3選擇標 記的YEp或YCp質粒。2) 對于誘發突變，將重要基因
酵母細胞質粒分離實驗
在非選擇性生長條件下，大多數大腸桿菌/酵母菌穿梭載體的丟失頻率大約1%，采用本方案不易分離除去的一個質粒是內源性2 μm 質粒，2 μm DNA自發丟失的頻率約為每代10-4。實驗材料酵母試劑、試劑盒YPD儀器、耗材接種針培養瓶搖床實驗步驟1. ?挑取幾個含質粒的酵母宿主菌菌落，接種于10 ml 非
酵母細胞質粒分離實驗
實驗材料 酵母試劑、試劑盒 YPD儀器、耗材 接種針培養瓶搖床實驗步驟 1. ?挑取幾個含質粒的酵母宿主菌菌落，接種于10 ml 非選擇性培養基，于30℃培養過夜。 2. ?在非選擇性平板上于30℃培養2天以得到單菌落，大多數情況下，可以得到約200~300個單菌落（約每平板100個菌落）。 3.
關于酵母質粒載體的基本介紹
酵母質粒載體是基因表達載體的一種,既可以在大腸桿菌中、又可以在酵母系統中進行復制與擴增,所以也稱為穿梭載體。它分為整合載體和自我復制載體兩類。 ①整合載體：它帶有一個酵母URA3標志基因和大腸桿菌的復制和報告基因。 ②自我復制載體：該類載體在酵母中可以自我復制。
酵母質粒載體的概念和分類
酵母質粒載體是基因表達載體的一種，既可以在大腸桿菌中、又可以在酵母系統中進行復制與擴增，所以也稱為穿梭載體。它分為整合載體和自我復制載體兩類。①整合載體：它帶有一個酵母URA3標志基因和大腸桿菌的復制和報告基因。②自我復制載體：該類載體在酵母中可以自我復制。
酵母菌落直接質粒轉化法
酵母菌落直接質粒轉化法1．用牙簽從平板中挑取單菌落（直徑2～3mm），轉移到1.5ml的無菌離心管中。2．將10μl載體DNA（100μg）與10μl轉化質粒DNA混合，振蕩均勻。（若轉化DNA是用未經RNA酶處理的“mini－prep DNA”方法制得，則不需加載體DNA）。3．加0.5ml PL
酵母質粒提取離心法操作步驟
酵母質粒提取離心法操作步驟：1.接種5 mL含有酵母攜帶所需質粒的YDP培養液，將其振蕩培養在30℃16-24小時。2.取1-3ml酵母培養菌體(使用< 2×107細胞)，室溫下5000× g離心5 min。3.棄培養液，收集菌體，加入480μL Buffer SE和30μL Lyticase so
質粒的轉化及轉化子的鑒定實驗——電轉化法
實驗方法原理電轉化法：外加于細胞膜上的電場造成細胞膜的不穩定，形成電穿孔，不僅有利于離子和水進入細菌細胞，也有利于孔DNA等大分子進入。同時DNA在電場中形成的極性對于它運輸進細胞也是非常重要的。實驗材料外源片段與載體的連接產物大腸桿菌感受態細胞試劑、試劑盒X-galAmpLA培養基水抗生素儀器、耗
為什么要質粒轉染
轉染(transfection)：指真核細胞由于外源DNA摻入而獲得新的遺傳標志的過程。常規轉染技術可分為瞬時轉染和穩定轉染（永久轉染）兩大類。轉染目的：研究你的目的片段到細胞內的表達。轉染一般是將目的基因構建到某個載體，將構建好的重組質粒導入細胞中，這樣就能表達你所要的目的蛋白用于后續實驗。
酵母細胞中質粒的加工實驗
實驗方法原理 在非選擇性生長條件下，大多數大腸桿菌/酵母菌穿梭載體的丟失頻率大約1%。 在本方案中含質粒的酵母菌株接種于非選擇性平板上以分離質粒并可得到單菌落。然后通過影印到選擇性平板上可以鑒別丟失了質粒的菌株實驗材料 含質粒的酵母菌株試劑、試劑盒 YPD或其他非選擇性液體培養基及平板CM缺失成分
酵母細胞中質粒的加工實驗
定位突變質粒缺口修復技術和等位基因修復技術實驗材料酵母菌株試劑、試劑盒帶選擇標記的YRp或YCp質粒適當的限制性內切核酸酶相應選擇標記突變的酵母菌質粒標記的選擇培養基平板儀器、耗材培養皿實驗步驟1）將目的基因亞克隆到帶恰當的選擇標記的YRp或YCp質粒上。2) 在基因內部的兩個限制酶酶切位點上切割以
酵母質粒載體具備的條件有哪些？
一個理想的基因載體應該具有以下幾個基本條件： ①能在宿主細胞進行獨立和穩定的DNA自我復制,并在其DNA中插入外源基因后,仍然保持著穩定的復制狀態和遺傳特性； ②易于從宿主細胞中分離,并進行純化； ③在其DNA序列中,具有適當的限制性內切酶位點(最好是單一酶切位點)。這些位點位于DNA復制
酵母質粒載體的基本信息介紹
酵母質粒載體是基因表達載體的一種,既可以在大腸桿菌中、又可以在酵母系統中進行復制與擴增,所以也稱為穿梭載體。它分為整合載體和自我復制載體兩類。①整合載體：它帶有一個酵母URA3標志基因和大腸桿菌的復制和報告基因。由于質粒DNA與酵母基因組DNA之間發生了同源重組,在轉化的細胞中可以檢測到質粒的整
提高自制酵母細菌電轉化效率最重要的兩點
一:生長期重要性無庸置疑,比如外源DNA基因組整合時,酵母通常選取OD600值為1-2左右.這是因為其時酵母分裂旺盛,細胞核膜較易被攻入(處于有絲分裂的前幾期);同理,基因組DNA松散暴露,電轉入的外源DNA較易整合; 細胞生命力也較強. 多種因素組合,使得轉化率得以提高.二:將你的細胞洗干凈些很多
酵母細胞質粒提取步驟和酵母細胞破壁方法
酵母細胞的細胞壁比較厚，不容易破壁，不如大腸桿菌的質粒 容易提取，最近做了些釀酒酵母的實驗，從釀酒酵母中提取質粒，現在就總結下實驗的方法和步驟。酵母細胞質粒提取 步驟1. 接種單菌落(待檢測酵母細胞)于25mLYNB(補加氨基酸 營養物)培養基中，30℃振蕩培養過夜。2.第二天取一滴菌液于進行顯微鏡
克隆化酵母DNA的操作實驗——穿梭質粒
實驗材料酵母實驗步驟1. ?構建其必需基因的染色體拷貝已被破壞的單倍體菌株，及帶有完整的必需基因和URA3選擇標志的YEp質粒。2. ?將必需基因亞克隆到YCp載體（帶有URA3以外的選擇標志），取約10~20 μg 用羥胺或其他技術進行誘變。3. ?轉化至步驟1的菌株中，在添加了尿嘧啶的省卻成分平
為什么要將pei加到質粒里
這是程序就這么設計的。無論是轉染還是轉化，其關鍵因素都是用氯化鈣處理大腸桿菌細胞，以提高細胞膜的通透性，從而使外源DNA分子能夠容易進入細胞內部。所以在習慣上，人們往往也通稱轉染為廣義的轉化。常規轉染技術可分為瞬時轉染和穩定轉染（永久轉染）兩大類。pei原理：外源基因進入細胞主要有四種方法：電擊法、
克隆化酵母DNA的操作實驗——質粒缺口修復
實驗材料酵母實驗步驟1. ?將目的基因亞克隆到YRp質粒，通過基因內的兩個限制性位點在基因中創造一個缺口區，在缺口兩側留下≥100~250 bp 的同源區，凝膠電泳純化質粒骨架大片段。?2. ?用1~10 μg?缺口質粒DNA轉化待拯救的含突變等位基因的酵母菌株，通過YRp質粒上的選擇基因進行選擇，
電轉化流程
一、電轉化感受態細胞的制備1.用槍頭挑取單克隆菌落，投入盛有10ml LB液體培養基的50ml離心管中。（同時做培養基和槍頭的空白對照）2.37℃，220rpm，培養14-16個小時。3.第二天，以1：100的比例將這10ml菌液倒入1000ml LB液體培養基中，37度，220rpm，振搖2-3小
電轉化流程
一、電轉化感受態細胞的制備1.用槍頭挑取單克隆菌落，投入盛有10ml LB液體培養基的50ml離心管中。（同時做培養基和槍頭的空白對照）2.37℃，220rpm，培養14-16個小時。3.第二天，以1：100的比例將這10ml菌液倒入1000ml LB液體培養基中，37度，220rpm，振搖2-3小