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探針是能與特異靶分子反應并帶有供反應后檢測的合適標記物的分子。利用核苷酸堿基順序互補的原理,用特異的基因探針即識別特異堿基序列的有標記的一段單鏈DNA（或RNA）分子,與被測定的靶序列互補,以檢測被測靶序列的技術叫核酸探針技術。探針制備就是將目的基因進行標記。特異性探針有三種形式——cDNA、RNA、寡核苷酸。cDNA和寡核苷酸是最常采用的探針。RNA探針用途很廣,也容易獲得,但其不穩定性限制了其商業用途。cDNA探針的獲得是,將特定的基因片段裝載到質粒或噬菌體中,經過擴增、酶切、純化等復雜的步驟,才能得到一定長度的cDNA探針。這一過程比較復雜,有相應條件的實驗室才能做到。寡核苷酸探針是在已知基因序列的情況下,由核酸合成儀來完成,可廉價獲得大量的此類探針。質量也相對來說更為穩定。由于cDNA探針長度通常為數百至數千個堿基,所以有良好的信號放大作用,但其滲透性比較差。寡核苷酸探針一般為十數個至數十個堿基,滲透性強,但信號放大......閱讀全文
探針是能與特異靶分子反應并帶有供反應后檢測的合適標記物的分子。利用核苷酸堿基順序互補的原理,用特異的基因探針即識別特異堿基序列的有標記的一段單鏈DNA（或RNA）分子,與被測定的靶序列互補,以檢測被測靶序列的技術叫核酸探針技術。探針制備就是將目的基因進行標記。特異性探針有三種形式——cDNA、R
為了確定探針是否與相應的基因組DNA雜交,有必要對探針加以標記,以便在結合部位獲得可識別的信號,通常采用放射性同位素32P標記探針的某種核苷酸α磷酸基。但近年來已發展了一些用非同位素如生物素-親合素系統、地高辛配體等作為標記物的方法。非同位素標記的優點是保存時間較長,而且避免了同位素的污染。最常
①缺口平移標記法。利用的是DNA聚合酶I能修復DNA鏈的功能。該法先由DNaseI在DNA雙鏈上隨機切出切口,然后DNA聚合酶I沿缺口水解5′端核苷酸,同時在3′端修復加入被標記核苷酸,切口平行推移。缺口平移法快速、簡便、成本相對較低、比活性相對較高、標記均勻,多用于大分子DNA標記,(>100
轉錄標記(transcription labeling)是利用啟動子(oromoter)結合 RNA 聚合酶啟動轉錄的特性設計的一種標記方法。Melotn(1984)等將目的 DNA 片段克隆到含 SP 啟動子的載體上,目的基因位于啟動子下游,加上 RNA 聚合酶,轉錄合成了 RNA 探針。與切口平
PCR 技術是1985年 KarryMullis 等首先創建的可在體外迅速、大量地擴增一定長度的核苷酸序列的技術。PCR問世以來已廣泛應用于分子生物學研究和疾病診斷中。此技術還應用于核酸探針的制備。Girgsi 等(1988)應用 PCR 從多序列制備了 DNA 探針。Shcow-aletr 和 S
進行分子突變需要大量的探針拷貝,后者一般是通過分子克隆（molecular cloning）獲得的。克隆是指用無性繁殖方法獲得同一個體、細胞或分子的大量復制品。當制備基因組DNA探針前,應先制備基因組文庫,即把基因組DNA打斷,或用限制性酶作不完全水解,得到許多大小不等的隨機片段,將這些片段體外
實驗概要核酸探針根據核酸的性質，可分為DNA和RNA探針;根據是否使用放射性標記物與否,可分為放射性標記探針和非放射性標記探針;根據是否存在互補鏈,可分為單鏈和雙鏈探針;根據放射性標記物摻入情況,可分為均勻標記和末端標記探針。實驗原理分子生物研究中，最常用的探針即為雙鏈DNA探針，它廣泛應用于轉基因
隨機引物標記(random primer labeling)是利用單鏈 DNA 與六核苷酸(hexamer)退火結合,以六核苷酸為引物,加入4種 dNTP,其中1種標有同位素或生物素,用 Klenow 片段催化合成帶有標記的互補 DNA 鏈,標記率高而且不受瓊脂糖影響。該法不適于標記 RNA。Fei
末端標記(end labeling)是利用酶學方法或化學方法將標記物,如同位素、生物素、熒光素等標記到核苷酸鏈的5'或3'端制備探針。酶學方法中常用的酶有:經枯草桿菌蛋白酶水解大腸桿菌 DNA 聚合酶Ⅰ形成具有5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性
1.缺口平移法(nick translation)缺口平移法是最常用的探針標記法,反應體系的主要成分有DNA酶I(DNase I)、大腸桿菌DNA聚合酶I(DNA polymerase I)、三種三磷酸脫氧核糖核苷酸、一種同位素標記的核苷酸(如dATP、dTTP、dCTP,”P—dGTP),其原理如