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使用雙功能團試劑將合成肽偶聯至載體蛋白實驗步驟基 本 方 案 使用雙功能團試劑將合成肽偶聯至載體蛋白材 料家兔肽-載體的連接體（單 元 13. 1)P B S , p H 7. 5弗 氏 完 全 佐 劑（F C A ; Pierce Biotechnology)弗氏不完全佐劑1 . 收 集 血 樣（如從耳動脈或耳靜脈），每只家兔準備 2?5m l 免 疫 前 的 血 清（單 元 1.2)。至少準備 2 只家兔，以防一只家兔死亡或者免疫接種失敗。2 . 將 0.7?L O m g 的肽-載體的連接體溶于 I m l 的 P B S ， 并 加 入 Iml F C A 徹底混溶。每只 家 兔 免 疫 接 種 I m l 這 種 穩 定 的 乳 濁 液 ，在 皮 下 多 個 位 點 接 種 ，每 個 位 點 0.1?0?2 ml (單元 1. 2 ) 。3.2?6 周 后（或檢測到免疫反應減弱時較理想；見基本方案 2)，準備一份新的乳......閱讀全文
實驗步驟基 本 方 案 1 塑 料 黏 附 和E A 玫 瑰 花結 富 集DC此種技術用于分離DC已經使用了很多年，其間只經過了微小的修改（Steinman衫aZ.， 1979)材 料（帶V 項 目 見 附 錄 1)膠原酶消化的脾臟細胞懸液（見輔助方案）高密度牛血清白蛋白（BSA) 溶液R P M
實驗步驟 基 本 方 案 巨 細 胞 病 毒 感 染 小 鼠 模 型材 料B A B L /c 小 鼠（新生或成鼠）或其他品系純化的鼠巨細胞病毒（m C M V ; 見輔助方案 1 ) 或 唾 液 腺 病 毒（S G V ，見輔助方案2 )完全培養基鋼 網（0 ?45m m )Ia.感染新
實驗步驟一、材料1. 胞質分裂阻滯微核試驗2. 微核的著絲點檢測(1)從硬皮病 C R E S T 亞型的患者中取得的血清樣本。(2) F I T C 標記的兔抗人 I g G 二抗。(3) 過氧化物酶標記的兔抗人 I g G 。(4) 二胺基聯苯溶液（D A B ): I m g /m L 溶于
實驗步驟 一、材料 1. 胞質分裂阻滯微核試驗 2. 微核的著絲點檢測 (1)從硬皮病 C R E S T 亞型的患者中取得的血清樣本。 (2) F I T C 標記的兔抗人 I g G 二抗。 (3) 過氧化物酶
實驗步驟一、膜的制備從細胞或組織中分離質膜是純化膜蛋白的第一步。由于缺少能有效分離去污劑增溶的膜蛋白的生化方法，因此在質膜成分純化上投人一些時間會對后續步驟的結果有利。大多數膜蛋白的含量較低, 因此選擇易于大量獲取并能高表達目的膜蛋白的組織或細胞系就很重要。最近，人們對于將細胞表面蛋白質作為鑒定不同
實驗步驟 一、膜的制備 從細胞或組織中分離質膜是純化膜蛋白的第一步。由于缺少能有效分離去污劑增溶的膜蛋白的生化方法，因此在質膜成分純化上投人一些時間會對后續步驟的結果有利。 大多數膜蛋白的含量較低, 因此選擇易于大量獲取并能
1.將2 管 I m l 的 4000U /m l 膠 原 酶 D 稀 釋（足夠用于2 0 個脾臟）： Im l 加 入 9m l H B S S(稀 釋 至 400U /m l ，步 驟 8 使用）， I m l 加 入 39m l 的 H B S S (稀 釋 至 100U /ml)。置
三、膜蛋白的純化一 旦 使 用 了 合 適 的 去 污 劑 將 膜 蛋 白 從 細 胞 膜 中 増 溶 出 來 ，就 可 以 分 離 目 標 蛋 白 質 了 。傳 統 色 譜 層 析 技 術 ，如 凝 膠 過 濾 、親 和 、離 子 交 換 和 層 析 聚 焦 （chromatofocusi
翻譯后修飾蛋白質的定性和定量實驗 實驗步驟
基本方案 一 種 抗 原 加 工 處 理 和 呈 遞 的 檢 測 體 系材 料具有增殖能力的（如轉化的 B 細胞）或非增殖的且與 T 雜交瘤細胞 M H C 匹配的抗原呈遞細胞（單 元 7.1)D M E M -1 0 完全培養基， 37°C對數生長期的 T 雜交瘤細胞抗原：溶解于水的蛋白質或多肽（
實驗步驟基本方案 一 種 抗 原 加 工 處 理 和 呈 遞 的 檢 測 體 系材 料具有增殖能力的（如轉化的 B 細胞）或非增殖的且與 T 雜交瘤細胞 M H C 匹配的抗原呈遞細胞（單 元 7.1)D M E M -1 0 完全培養基， 37°C對數生長期的 T 雜交瘤細胞抗原：溶解于水的蛋白質
3.2 免 疫 B 細胞的制備血清效價有意義(>1 : 1000)的免疫后動物可以提供抗原反應性B 細胞用于融合。這些細胞可以從脾臟或淋巴結中獲得。動物用吸人CO2 處死，在無菌操作下取組織，放 在 4°C無血清培養基中，最多可放lh 。用懾子或針頭輕輕打開組織脾臟或淋巴結的外包膜獲得
基 本 方 案 淋 巴 細 胞 的 CFSE 標記材 料（帶 V 項 目 見 附 錄 1)實驗動物，人外周血或者培養的淋巴細胞VPBS, pH7. 4H a n k s 平 衡 鹽 溶 液（H B S S ) p H 7. 4含 5 % (V /V ) 熱 滅 活 F B S 的 P B S5m m
實驗步驟基 本 方 案 淋 巴 細 胞 的 CFSE 標記材 料（帶 V 項 目 見 附 錄 1)實驗動物，人外周血或者培養的淋巴細胞VPBS, pH7. 4H a n k s 平 衡 鹽 溶 液（H B S S ) p H 7. 4含 5 % (V /V ) 熱 滅 活 F B S 的 P B S
基 本 方 案 FicoH-Hypaque梯度離心法分離單個核細胞材 料肝 素 抗 凝 血（附 錄 3 G ) 或 者 肝 素 化 的 臍 帶 血（I Oml臍 帶 血 加 入 I m l 含 250U 的P B S 為宜）P B S聚蔗糖-泛影葡胺（Ficoll-Hypaque) 溶液H B S
實驗步驟2.3 小 鼠 胚 胎 飼 養 細 胞（MEF) 的 制 備最廣泛地用于支持 h E S 的伺養層細胞來自小鼠胚胎 [丁]^〇 1113 〇 1161&1,， 1998;Reu-binoffetal. ， 2000]，如小鼠胚胎飼養細胞（MEFs) ，盡管它們可能是最原始的間葉細胞的
細 胞 培 養 基 成 分 小 鼠 胚 胎 飼 養 細 胞（MEF) 的 制 備 人 胚 胎 干 細 胞 系 的 建 立 h E S 細 胞 的 手 工 傳 代 采 用 玻 璃 化 方 法 凍 存 h E S 細胞 通 過 焚 光
細 胞 培 養 基 成 分 小 鼠 胚 胎 飼 養 細 胞（MEF) 的 制 備 人 胚 胎 干 細 胞 系 的 建 立 h E S 細 胞 的 手 工 傳 代 采 用 玻 璃 化 方 法 凍 存 h E S 細胞 通 過 焚 光
實驗步驟 在 篩 選 檢 測（輔助方案 1 ) 方案完善之前不應進行細胞融合。由于在細胞融合后可對目標單克隆抗體進行檢測的次數是有限的，在細胞融合前必須檢查條件培養液以排除篩選時可能出現的人為因素影響。材 料SP2/0-Agl4 骨 髓 瘤 細 胞 系（藥物標記的非分泌型； ATCC)添加
實驗步驟基本方案 過 利 斯 特 氏 菌 刺 激 制 備 腹 腔 巨 噬 細 胞材 料單核細胞增多性利斯特氏菌無 菌 PBSH -2 相 合 小 鼠（見 表 A .2A .1)，包括正常和提前 3 周注射了利斯特氏菌的小鼠V冰浴的 D M E M 培養基3 % (V A O 乙酸0.4% (m /V
一、轉染方法對于脂質體轉染 (Upofection), 可以從商業途徑獲得許多配方，這些配方都具有單一的專利化組分，而且毫無疑問，它們中的大部分都能非常有效地將質粒 D N A 轉 人 細 胞 。其缺點是價格不菲—- 在使用這些試劑時，對于超出數百毫升規模的瞬時轉染，經濟上是不可行的。大
實驗步驟 一、轉染方法 對于脂質體轉染 (Upofection), 可以從商業途徑獲得許多配方，這些配方都具有單一的專利化組分，而且毫無疑問，它們中的大部分都能非常有效地將質粒 D N A 轉 人 細 胞 。其缺點是價格不菲
報道顯 TK，在 過 去 的 1 0 年 ，已經開發出 了多種高效的瞬時轉染（transient transfection) 方法 ， 它們可 以 滿 足 甚 至 超出 了 上 述 需 求 。 目 前 蛋 白 質 的 瞬 轉 表 達 主 要 是 在H E K 2 9 3 衍生的細胞系中進行, 而同時
2.2 糖基化糖 基 化 是 一 種 常 見 的 P T M , 并 且 已 經 證 明 能 夠 影 響 酶 的 活 性 、蛋 白 質 定 位 、穩 定 性 、信 號 轉 導 、細 胞 黏 附 和 蛋 白 質 相 互 作 用 (Spiro, 2002k 目 前 已 經 發 現 在 腫 瘤 惡
二、用 于 鑒 定 P T M 的富 集 技 術2.1 磷酸化絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸殘基的可逆磷酸化也許是研究最為深人的 PT M 。蛋白質磷酸化信號網絡介導細胞對與不同的應激因子、生長因子、細胞因子以及細胞間相互作用作出響應。憐酸化還影響多種細胞進程，如增殖、凋亡 、遷移 、轉錄和蛋白質翻譯（W
實驗步驟感 染 CD4+ 原 代 細 胞 系 及 H I V 的誘導基本方案1 用 H IV 體 外 急 性 感 染CD4 + 原代細胞及細胞系表9.2.1列出了一些最常用于體外H I V 感 染 的 C D 4 + 靶細胞。用其他不同譜系的C D 4 + 細胞系也可獲得相應的結果，還 有 一 些
實驗步驟 一、材料1. 胞質分裂阻滯微核試驗2. 微核的著絲點檢測(1)從硬皮病 C R E S T 亞型的患者中取得的血清樣本。(2) F I T C 標記的兔抗人 I g G 二抗。(3) 過氧化物酶標記的兔抗人 I g G 。(4) 二胺基聯苯溶液（D A B ): I m g /m L 溶于
實驗步驟基 本 方 案 直 標 法 檢 測 小 鼠 巨 噬 細 胞 的 表 型材料Sorvall RT 6000B 離心機I . 準 備 4 只 12m m X 75m m 試管，將試管編號為 1?4。每 管 中 加 入 2 X IO7個細胞/ml細胞懸液 50ul。2.每管加入 3 mg/ml 阻
基 本 方案 酪 氨酸 蛋白 激酶 的免 疫 沉淀 和自 身 磷 酸化 檢 測以下步驟可以釆用淋巴或非淋巴細胞、原代細胞或培養的細胞系、活化或非活化的細胞。材 料（帶 V 項 目 見 附 錄 1)待檢測的細胞 冰預冷的 PBS含蛋白酶抑制劑的 I X 細 胞 裂 解 液（新鮮配置并于冰上保存）含蛋白
實驗步驟基 本 方案 酪 氨酸 蛋白 激酶 的免 疫 沉淀 和自 身 磷 酸化 檢 測以下步驟可以釆用淋巴或非淋巴細胞、原代細胞或培養的細胞系、活化或非活化的細胞。材 料（帶 V 項 目 見 附 錄 1)待檢測的細胞 冰預冷的 PBS含蛋白酶抑制劑的 I X 細 胞 裂 解 液（新鮮配置并于冰上保存