24cmIPG膠條二維電泳
實驗概要本實驗應用二維電泳(two-dimensional gel electrophoresis，2DE)技術對提取的2D大鼠視網膜組織蛋白進行分離，獲得了分辮率高和重復性好的2DE圖像，建立了2DE分離技術的平臺，為進一步研究莫定了基礎。實驗步驟1. 清洗器具用品：清洗所有的干膠條套件，包括膠條槽、蓋片、托盤等。用Ettan IPGphor膠條槽清洗劑(Amersham Biosciences.)，并用大量去離子水沖洗，自然干燥備用。2. 第一向等電聚焦電泳 1) 加樣和IPG干膠條再水化：采用樣品加在再水化液中方法進行加樣。24cm IPG膠條(PH3 -10Non-line )。銀染蛋白質上樣量為40ug-50ug。根據上樣量計算出樣品上樣的體積，加入樣品水化液，使總體積為450ul，充分混勻。將液體平鋪在膠槽內。取24cmIPG干膠條，從酸性端(尖端)一側剝去膠條保護膜，膠面向下，先將陽性端......閱讀全文
一維固相pH梯度等電聚焦－(IEF－with－IPG)——IPG－IEF－pH－梯度的選擇
實驗材料膠條實驗步驟對一新樣品，常最先使用寬范圍、線性PH3.5-10梯度 但對大多數樣品，這樣做會喪失 pH4-7 區域的分辦率，許多蛋白質的 pI 值在該區域。利用非線性 pH3.5-10 IPG IEF 膠在一定程度緩解這個問題。 PH3.5-10 非線性膠條在 pH4-7 區域的梯度要比 p
雙向電泳實驗——IPGDALT－方法
試劑、試劑盒尿素去污劑還原劑載體兩性電解質儀器、耗材IPG 凝膠實驗步驟一、第一向1. 固相 pH 梯度凝膠或凝膠條的準備固相 pH 梯度凝膠的灌注及聚合方法請參閱 固相 pH 梯度等電聚焦 有關章節，如需要可切成 3~5 mm 寬的膠條在 -20℃ 保存一年。為避免繁瑣和復雜的灌膠和切膠條程序和保
一維固相－pH－梯度等電聚焦－(IEF－with－IPG)
實驗方法原理 IPG IEF 膠用 Immobilines制備。 lmmobilines 是擁有 結構的8 種丙烯酰胺衍生物系列，其中 R 包含羧基或叔氨基團，它們構成了分布在 pH3-10 不同值的緩沖體系。根據公布的配方估算后，將適宜的 IPG 試劑添加至混合物中用于凝膠聚合，在聚合
24cm－IPG膠條二維電泳
實驗概要本實驗應用二維電泳(two-dimensional gel electrophoresis，2DE)技術對提取的2D大鼠視網膜組織蛋白進行分離，獲得了分辮率高和重復性好的2DE圖像，建立了2DE分離技術的平臺，為進一步研究莫定了基礎。實驗步驟1. 清洗器具用品：清洗所有的干膠條套件，包括膠條
一維固相－pH－梯度等電聚焦－(IEF－with－IPG)
基本方案 膠條處理 加樣 IPG IEF pH 梯度的選擇 聚焦時間的優化 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 IPG
一維固相－pH－梯度等電聚焦－(IEF－with－IPG)——加樣
實驗材料蛋白樣品實驗步驟樣品通常是加在放置在?IPG?膠陽極區或陰極區的硅橡膠框內或特殊加樣杯內（圖3. lg, h),?對不同類型的樣品，最好的加樣位置由經驗值確定。最初電壓衛限制在150V?、?30min,?從而使盡隊多的樣品進入加樣杯，然后逐漸增加電壓至3500 V?。運行時間決定了幾個不同的
一維固相－pH－梯度等電聚焦－(IEF－with－IPG)——基本方案
實驗方法原理IPG IEF 膠用 Immobilines制備。 lmmobilines 是擁有?結構的8 種丙烯酰胺衍生物系列，其中 R 包含羧基或叔氨基團，它們構成了分布在 pH3-10 不同值的緩沖體系。根據公布的配方估算后，將適宜的 IPG 試劑添加至混合物中用于凝膠聚合，在聚合中，緩沖基團通
一維固相－pH－梯度等電聚焦－(IEF－with－IPG)——膠條處理
實驗材料膠條實驗步驟用于2-DE 時，膠條應該散于重泡脹池（圖 3, ld) 中在含 5mol/L 尿素的溶液（或2mol/L 硫脲和 5mol/L 尿素）中泡脹。溶液其成分為 0,5% 到 4% 非離子（NP-40,Triton X-100) 或兩性 (CHAPS) 去污劑、 15mmol/LDT
一維固相－pH－梯度等電聚焦－(IEF－with－IPG)——聚焦時間的優化
實驗材料蛋白樣品實驗步驟理論上講，要獲得最好的圖譜質量和重復性所需最佳時間是 IEF 分離達到穩定態所需的時間 。 若聚焦時間太短，會導致水平和垂直條紋，但要避免過度聚焦 。 雖然與經典 O'Farrell 法相比，不會導致蛋白質向陰極的遷移（陰極漂移），但卻會因為活性水轉運而導致過多水在
植物蛋白質組學中的雙向電泳技術實驗（一）
試劑、試劑盒?尿素裂解溶液IPG 干膠條水化液IPG 膠條平衡液SDS 凝膠緩沖液電極緩沖液儲液丙烯酰胺 甲叉雙丙烯酰胺溶液過硫酸銨溶液瓊脂糖溶液儀器、耗材?等電聚焦儀 IPGphor多重垂直 SDS 電泳儀實驗步驟 3.1 第一向：在 IPG 膠條中進行等電聚焦（ IPG-IEF)采用 IPG (
植物蛋白質組學中的雙向電泳技術實驗
試劑、試劑盒尿素裂解溶液 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?? IPG 干膠條水化液 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?
植物蛋白質組學中的雙向電泳技術實驗
試劑、試劑盒尿素裂解溶液IPG 干膠條水化液IPG 膠條平衡液SDS 凝膠緩沖液電極緩沖液儲液丙烯酰胺 甲叉雙丙烯酰胺溶液過硫酸銨溶液瓊脂糖溶液儀器、耗材等電聚焦儀IPGphor多重垂直 SDS 電泳儀實驗步驟3.1 第一向：在 IPG 膠條中進行等電聚焦（ IPG-IEF)采用 IPG ( IPG
植物蛋白質組學中的雙向電泳技術實驗（三）
使用 IPGphor 進行 IEF 的典型工作條件見表13-2和 表 13-3 。正如前文指出的那樣 ，為了使高分子質量的蛋白質更好地進入聚丙烯酰胺膠內，水化時應在膠條兩端加低電壓（30~50 V ) ，否則將給水化上樣造成困難[ 15，28] 。然后電壓逐步升高至 8000 V。如果 IP
植物蛋白質組學中的雙向電泳技術實驗（二）
2. 在平板儀器上進行 IPG-IEF ( Multiphor ll Unit)滿足下列條件時，水化后的 IPG 膠條可以直接放在 IEF 儀器的冷卻板上：① 如果運行時間不超過 12 h ( 經常發生在寬的或中等 pH 范 圍 IPG，如 IPG 3~10 或 4~7 ) 。② 如果 pH 梯
固相化－pH－梯度雙向凝膠電泳實驗8
方案8 第二向：蛋白質的 SDS-PAGE 實驗實驗方法原理在第一向 IEF 和 IPG 膠條平衡之后，需進行第二向 SDS-PAGE。SDS-PAGE 是基于蛋白質分子量的不同而將其分離的。這種分離系統可從多家供應商處獲得，在許多蛋白質化學實驗室中也普遍使用。這里介紹放置 IPG 膠條的方法以及第
2－Dimensional－Gel－Electrophoretic－Analysis－for－Chicken－Egg
Overview?? ? This protocol is a detail description of the procedure in performing 2D gel electrophoresis for illustrating the protein profile of the w
ZOOM?－IPGRunner?系統：簡化的雙向電泳（2D－gel－eletrophoresis）
摘要雙向電泳（Two-dimensional（2D） gel electrophoresis）是一項基于蛋白的兩種不同特性：電荷和質量來分離蛋白的技術。首先基于蛋白固有電荷，通過等電聚焦（isoelectric focusing IEF）進行第一向蛋白分離，然后根據蛋白的質量，在第二向中通過SDS-
固相化－pH－梯度雙向凝膠電泳實驗5
方案5 第一向：蛋白質的等電聚焦電泳實驗實驗方法原理這里所描述的分離蛋白質的兩種方法都是基于蛋白質所帶凈電荷的多少，使用固相化的 pH 梯度凝膠進行的 IEF 技術。這些方法作為雙向凝膠分離的第一向，除了利用傳統的水平電泳儀進行 IPG 凝膠的等電聚焦外（方案 5 方法 A)，還能在自帶的電泳槽里使
等電聚焦和二維凝膠電泳實驗（四）
再水化上樣是二維凝膠電泳樣品導入的最簡便方法，這一方法使得樣品緩沖液中的蛋白質樣品在 IPG 膠條吸收樣品溶液時被動導入，且蛋白質可以在整個 pH 梯度中均勻分布。在一些商品化的等電聚焦儀器中，IPG 膠條的再水化和聚焦可以用相同設備儀器完成，無需人工操作。這種儀器也可以進行所謂的主動再水化
雙向電泳(twodimensional－electrophoresis,2DE)4
由于合成載體兩性電解質（synthetic carrier ampholyte SCA）是通過復雜的合成過程得到的，其重復性很難控制，由此不同批次之間會存在很大的變化，同一蛋白質在不同批 圖-1. 等電聚焦的“聚焦效應” 次等電聚焦中所出現的位置有所偏差，這樣作為雙向電泳中的一向時就限
植物蛋白質組學中的雙向電泳技術實驗（四）
3.3 第二向：多重垂直 SDS-PAGESDS-PAGE 可以在水平或垂直系統上進行 [29] 。水平設備適用于預制膠（ExcelGel SDS；Amersham Biosciences/ GE Healthcare) 。而垂直系統則應用于多塊膠平行進行的電泳中，尤其是大規模的蛋白質組分析
等電聚焦和二維凝膠電泳實驗（一）
試劑、試劑盒 樣品緩沖液羥乙基二硫化物細胞裂解緩沖液SDS-PAGE 現成溶液二硫蘇糖醇碘乙酰胺儀器、耗材 等電聚焦電泳系統二維SDS-PAGE 多凝膠系統恒溫循環器IPG 干膠條溶脹盤上樣杯旋轉搖動混合器實驗步驟 一、等電聚焦的基本原理等電聚焦 (IEF) 是一種能根據分子內的質子接受點的 p
Two－Dimensional－Gel－Electrophoretic－Analysis－for－the－Human－Plasma－Proteome
OverviewThis protocol is a detail description of the laboratory procedure in performing 2D gel electrophoresis for illustrating the protein profile of
小鼠心臟組織蛋白樣品的蛋白質組學分析
實驗步驟1. 蛋白質雙向電泳1) 第一向固相pH梯度等電聚焦電泳a. 上樣：第一向等電聚焦采用膠內加樣的方法進行。精確吸取一定量的蛋白樣品(銀染樣品的蛋白上樣量為140 ug計，考染樣品為1.3 mg)加入重泡漲液(8 mol/L尿素，2%CHAPS，痕量濱酚藍，20 mmol/L DTT，0.
等電聚焦和二維凝膠電泳實驗
對于復雜混合物，如全細胞裂解物或富集的亞細胞組分，通過兩步正交的分離 (orthogonalseperation)，二維凝膠 (2D 膠）電泳可以很好地分離成幾百個至上千個單個蛋白質。第一次分離基于電荷，即使用變性等電聚焦電泳; 第二次分離基于表觀分子質量，即使用變性十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電
等電聚焦和二維凝膠電泳實驗
等電聚焦和二維凝膠電泳實驗 ? ? ? ? ? ? 試劑、試劑盒 樣品緩沖液 羥乙基二硫化物 細胞裂解緩沖液
雙向電泳
蛋白質組研究的發展以雙向電泳技術作為核心. 雙向電泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分離約1 000個E.coli蛋白，并表明蛋白質譜不是穩定的，而是隨環境而變化. 雙向電泳原理簡明，第一向進行等電聚焦，蛋白質沿pH梯度分離，至各自的等電點；隨后，再沿垂直的方向進行分子量
雙向電泳的操作步驟
第一向等電聚焦⒈ 從冰箱中取-20℃冷凍保存的水化上樣緩沖液（I）（不含DTT，不含IPG buffer）一小管（1ml/管），置室溫溶解。⒉ 在小管中加入0.01g DTT， 0.5% 對應膠條pH范圍的IPG buffer，充分混勻。⒊ 從小管中取出400微升水化上樣緩沖液，加入100微升樣品（
雙向電泳的操作步驟
第一向等電聚焦⒈ 從冰箱中取-20℃冷凍保存的水化上樣緩沖液（I）（不含DTT，不含IPG buffer）一小管（1ml/管），置室溫溶解。⒉ 在小管中加入0.01g DTT， 0.5% 對應膠條pH范圍的IPG buffer，充分混勻。⒊ 從小管中取出400微升水化上樣緩沖液，加入100微升樣品（
蛋白質組技術的研究進展（一）
大規模基因組測序計劃的實施已改變生命科學的重心，在相當短的時期內，一些原核生物和某些低等真核生物的基因組序列已被測定. ?1995年，流感嗜血桿菌基因組序列首次被破譯，在此后不到兩年的時間，近50個細菌的基因組序列已被完成. ?然而，這僅僅是理解有機物功能的一個起點. 在基因組時代，許多DNA序列信