哺乳動物細胞瞬時基因轉移法制備重組蛋白實驗
一、轉染方法對于脂質體轉染 (Upofection), 可以從商業途徑獲得許多配方，這些配方都具有單一的ZL化組分，而且毫無疑問，它們中的大部分都能非常有效地將質粒 D N A 轉 人 細 胞 。其缺點是價格不菲—- 在使用這些試劑時，對于超出數百毫升規模的瞬時轉染，經濟上是不可行的。大規模的瞬時轉染方法要求轉染試劑能很容易大量獲取, 批次間的變化小以保證轉染的一致性。盡管也存在一些其他的選擇，如將殼聚糖 (chitosan) 及其衍生物和14D E A 2 作為轉染試劑（D a n g and L e o n g , 2006; Jiang and Sharfstein， 2008; K u s u m o t oet a L ， 2 〇〇 6)，但磷酸鈣（calcium phosphate) 介導的轉染以及基于聚乙烯亞胺 (polyethylenimine，PEI) 的質粒絡合 (plasmidc......閱讀全文
哺乳動物細胞瞬時基因轉移法制備重組蛋白實驗
實驗步驟 一、轉染方法 對于脂質體轉染 (Upofection), 可以從商業途徑獲得許多配方，這些配方都具有單一的ZL化組分，而且毫無疑問，它們中的大部分都能非常有效地將質粒 D N A 轉 人 細 胞 。其缺點是價格不菲
哺乳動物細胞瞬時基因轉移法制備重組蛋白實驗
一、轉染方法對于脂質體轉染 (Upofection), 可以從商業途徑獲得許多配方，這些配方都具有單一的ZL化組分，而且毫無疑問，它們中的大部分都能非常有效地將質粒 D N A 轉 人 細 胞 。其缺點是價格不菲—- 在使用這些試劑時，對于超出數百毫升規模的瞬時轉染，經濟上是不可行的。大
哺乳動物細胞瞬時基因轉移法制備重組蛋白實驗
報道顯 TK，在 過 去 的 1 0 年 ，已經開發出 了多種高效的瞬時轉染（transient transfection) 方法 ， 它們可 以 滿 足 甚 至 超出 了 上 述 需 求 。 目 前 蛋 白 質 的 瞬 轉 表 達 主 要 是 在H E K 2 9 3 衍生的細胞系中進行, 而同時
哺乳動物細胞基因穩定轉染的實驗
分析基因的功能常需要形成含有穩定整合了該基因的哺乳動物細胞系。在轉染中大約有1/104細胞將穩定整合外源因而可用一顯性（正向）選擇標記來分離穩定的轉化細胞。用可高效轉染的細胞系來確保轉染成功。另外，應包括合適的對照以確定目的基因無細胞毒性。實驗材料哺乳動物細胞試劑、試劑盒完全培養液儀器、耗材培養箱離
哺乳動物細胞基因穩定轉染的實驗
基本方案 ? ? ? ? ? ? 實驗材料 哺乳動物細胞 試劑、試劑盒
哺乳動物細胞基因穩定轉染的實驗
實驗材料 哺乳動物細胞試劑、試劑盒 完全培養液儀器、耗材 培養箱離心管實驗步驟 1. ?確定所要轉染的細抱系能呈獨立集落生長。對于貼壁細胞，在10 cm 組織培養培養皿中接種約100個細胞，培養10~12天，毎4天換液1次。亞甲藍染色后對成活的細胞集落進行計數。?2. ?確定母代細胞的選擇條件：將一
DNA重組（DNA－recombination）技術：外源基因的蛋白表達3
（6）遺傳標記： 從成千上萬個哺乳細胞中，檢測出極少數的含DNA重組體的轉染細胞，并鑒定已導入外源DNA是哺乳動物細胞基因表達系統的一個關鍵內容。因此，在真核生物表達載體上必須附有標記基因，才能進行篩選。常用的標記基因有：胸苷激酶基因（thymidine kinase，TK）、二氫葉酸還原酶
哺乳動物細胞真核表達系統為科學研究提供助力
哺乳動物細胞真核表達系統是哺乳動物細胞經過翻譯和再加工后產生的外源蛋白，在活性上遠優于原核表達系統和酵母、昆蟲細胞等真核表達系統，更接近天然蛋白。哺乳動物細胞表達系統可以提供較接近自然狀態的重組人蛋白的翻譯后修飾。在蛋白質表達過程中，會形成接近天然蛋白質的蛋白質折疊和聚合，具有活性蛋白質所必需的
重組蛋白的高產量瞬時表達
圖a. 用ELISA法測得培養液中IgG的含量；橫軸為天數，縱軸為IgG滴度。 采用高密度瞬時轉染（High-density transfection）的方法，可以在HEK-293 EBNA1細胞中大量表達重組蛋白。實驗表明，該方法具有操作簡單，培養周期短，轉染效率高，批次產量高的優
蛋白質在哺乳動物細胞中表達實驗
實驗材料載體（如 CDM 8）實驗步驟1. 將目的基因亞克隆至合適的載體中得到所需的重組 DNA 。用小量法（5 ml 培養液）或用 CsCl／溴化乙錠離心法純化重組 DNA。2. 在轉染的前一天，將 COS-7 細胞以約 20% 匯片的數量種入含 DMEM-2 CS 培養基的 100 mm 培養皿
蛋白質在哺乳動物細胞中表達實驗
基本方案 用COS細胞瞬時表達 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 實驗材料 載體（如 CD
蛋白質在哺乳動物細胞中表達實驗
實驗方法原理 實驗材料 載體（如 CDM 8）實驗步驟 1. 將目的基因亞克隆至合適的載體中得到所需的重組 DNA 。用小量法（5 ml 培養液）或用 CsCl／溴化乙錠離心法純化重組 DNA。2. 在轉染的前一天，將 COS-7 細胞以約 20% 匯片的數量種入含 DMEM-2 CS 培養基的 1
藥物研發的好幫手蛋白質表達系統
近年來，隨著生物藥市場和基因工程技術的發展，重組治療性抗體或者單抗的需求在生物藥中的比例也逐年上升。重組mAbs被應用于包括癌癥及免疫系統缺陷在內的許多疾病的治療當中。 重組mAbs通過基因工程技術改造后可以在多種宿主細胞表達。重組mAbs在表達后進行翻譯后修飾、蛋白質折疊、組裝及適當的糖
哺乳動物細胞真核表達系統的優勢有人想知道嗎
? 哺乳動物細胞真核表達系統則是通過脂質體或者是PEI的等轉染試劑在體外通過和質粒形成復合體， 將質粒導入細胞后進行瞬時表達。稱為瞬時表達的原因是因為質粒在真核細胞中不能擴增。并且不斷被細胞所降解，這種表達在一定的時間后就會消失。除非質粒被整合進入細胞的基因組，通過質粒上帶的篩選標記，通過篩選得到
哺乳動物中制備基因組DNA實驗——制備DNA
在DNA提取過程中應盡量避免使DNA斷裂和降解的各種因素，以保證DNA的完整性，為后續的實驗打下基礎。一般真核細胞基因組DNA有107-9bp，可以從新鮮組織、培養細胞或低溫保存的組織細胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等試劑存在下用蛋白酶K消化細胞，隨后用酚抽提而實現的。實驗材料動物組織試劑、
哺乳動物細胞基因突變試驗
哺乳動物體外培養細胞的基因正向突變試驗常用的測試系統有小鼠淋巴瘤L5178Y細胞，中國倉鼠肺V79細胞和卵巢CHO細胞的三個基因位點的突變，即次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT)、胸苷激酶(TK)及Na+／K+ATP酶(OUA)位點。HGRPT和Na+/K+ATP酶位點突變可用于上述三種細胞，O
基因物質的轉移和重組
（1）轉化：是受體菌直接攝取供體菌提供的游離DNA片段整合重組，使受體菌的性狀發生變異的過程。（2）轉導：是以溫和噬菌體為媒介，將供體菌的基因轉移到受體菌內，導致受體菌基因改變的過程。（3）接合：是受體菌和供體菌直接接觸，供體菌通過性菌毛將所帶有的F質粒或類似遺傳物質轉移至受體菌的過程。（4）溶原性
基因的轉移與重組（一）
? 遺傳型變異還可通過兩個不同性質細菌之間發生遺傳物質的轉移和重組而實現。在基因轉移中，提供DNA的細菌為供體，而接受DNA的細菌是受體。基因轉移后獲得重組的子代，即具有供體與受體菌二者的主要特性。實現基因轉移需要兩個基本條件：一是全部或部分供體菌的基因相應進入受體菌；二是在受體菌中形成重組（雜交)
基因的轉移與重組（二）
? 二、轉導 以噬菌體為媒介，把供細菌的基因轉移到受體菌內，導致后者基因改變的過程稱為轉導。 當噬菌體在細菌中增殖并裂解細菌時，某些DNA噬菌體（稱為普遍性轉導噬菌體)可在罕見的情況下（約105～107次包裝中發生一次)，將細菌的DNA誤作為噬菌體本身的DNA包入頭部蛋白衣殼內。當裂解細菌后，釋
藥物研發的好幫手—蛋白質表達系統
近年來，隨著生物藥市場和基因工程技術的發展，重組治療性抗體或者單抗的需求在生物藥中的比例也逐年上升。重組mAbs被應用于包括癌癥及免疫系統缺陷在內的許多疾病的治療當中。重組mAbs通過基因工程技術改造后可以在多種宿主細胞表達。重組mAbs在表達后進行翻譯后修飾、蛋白質折疊、組裝及適當的糖基化才能具有
哺乳動物中制備基因組DNA實驗
制備DNA ? ? ? ? ? ? 實驗材料 動物組織
哺乳動物中制備基因組DNA實驗
實驗材料 動物組織試劑、試劑盒 PBS乙酸銨乙醇酚氯仿異戊醇TE儀器、耗材 離心機搖床研缽實驗步驟 1. ?切下組織并立即剪成小塊，置于液氮中凍結。?2. ?將200 mg~1 g 的組織用預冷的研缽和研杵研碎，或用錘子將其搗為細粉末，每100 mg 組織用1. 2 ml 消化緩沖液懸浮。?3. ?
真核細胞表達系統3
由于腺病毒易于培養、純化，宿主范圍廣，故采用該類病毒構建的載體被廣泛應用腺病毒載體的構建依賴于腺病毒穿梭質粒和包裝載體之間的同源重組。但是哺乳動物細胞內的這種同源重組效率很低，利用細菌內同源重組法構建重組體效率會大大提高，即將外源基因插入到腺病毒穿梭質粒中，形成轉移質粒，將其線性化后與腺病毒包裝質粒
DNA重組（DNA－recombination）技術：外源基因的蛋白表達4
（3）CHO細胞穩定表達系統：動物細胞瞬時表達系統中外源基因沒有穩定地整合到宿主細胞染色體中，一染色體外DNA的形式存在。因而只能瞬時表達。要使外源基因在宿主細胞中高效、穩定地表達，必須建立一個穩定表達系統，包括適宜的表達載體、有效的基因轉染、標記基因和目標基因的選擇與共擴增、受體適當的受體細胞和培
基因物質轉移和重組的途徑
（1）轉化：是受體菌直接攝取供體菌提供的游離DNA片段整合重組，使受體菌的性狀發生變異的過程。（2）轉導：是以溫和噬菌體為媒介，將供體菌的基因轉移到受體菌內，導致受體菌基因改變的過程。（3）接合：是受體菌和供體菌直接接觸，供體菌通過性菌毛將所帶有的F質粒或類似遺傳物質轉移至受體菌的過程。（4）溶原性
細菌基因物質的轉移和重組
1.轉化：受體菌直接攝取供體菌提供的游離DNA片段整合重組。2.轉導：以噬菌體為媒介 ，將供體菌的基因轉移到受體菌內。3.接合：性菌毛 將供體菌所帶有的F質粒或類似遺傳物質轉移至受體菌的過程。主要見于革蘭陰性菌。4.溶原性轉換：噬菌體的DNA與細菌染色體重組。5.原生質體融合：兩種失去細胞壁的原生質
哺乳動物細胞體外剪接分析實驗
剪接反應的典型做法是使用核提取物，即 S100 提取物補充 SR 蛋白或粗提取物的部分純化組分，最常使用的是 HeLa 細胞的提取物。前體 mRNA 底物通常采用噬菌體聚合酶體外轉錄的方法來制備。本實驗來源「RNA 實驗指導手冊」主編：鄭曉飛。實驗方法原理剪接反應的典型做法是使用核提取物，即 S10
哺乳動物細胞體外剪接分析實驗
實驗方法原理 剪接反應的典型做法是使用核提取物，即 S100 提取物補充 SR 蛋白或粗提取物的部分純化組分，最常使用的是 HeLa 細胞的提取物。前體 mRNA 底物通常采用噬菌體聚合酶體外轉錄的方法來制備。實驗材料 前體 mRNA 底物試劑、試劑盒 ATP CP 混合物HEPES-KOH聚乙烯醇
哺乳動物細胞體外剪接分析實驗
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 剪接反應的典型做法是使用核提取物，即 S100 提取物補充 SR 蛋白或粗提取物的部分純化組分，最常使用的是 HeLa 細胞的提取物。前體 mRNA 底物通常采用噬菌體聚合酶體外轉錄的方法來制備。
哺乳類動物的基因轉移方法
哺乳類動物基因轉移方法，是將改建后的目的基因（或基因組片段）用顯微注射等方法注入實驗動物的受精卵（或著床前的胚胎細胞），然后將此受精卵（或著床前的胚胎細胞）再植入受體動物的輸卵管（或子宮）中，使其發育成攜帶有外源基因的轉基因動物。?根據外源基因導入的方法和對象的不同，制作轉基因動物的方法主要有顯微注